基于肝细胞微载体粘附立体培养体系雷公藤肝毒性研究.pdfVIP

基于肝细胞微载体粘附立体培养体系的雷 公藤肝毒性研究 周玲玲柳璋璞周学平宰 (南京中医药大学，江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，南京210029) 摘要：目的：建立使用微载体进行L02肝细胞系高密度培养的方法，探讨雷公藤主要毒性成分的肝毒性作用及机制。 方法：在限制贴壁的条件下，以Cytodex一3为材料进行L02肝细胞的三维立体培养，在光镜下观察其生长情况，探 究雷公藤内酯醇对肝细胞增殖能力的影响，并对细胞上清液的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、 u 等指标进行检测。结果：雷公藤内酯醇100g／m1组可明显抑制肝细胞的增殖，降低肝细胞活性，使细胞ALT、AST、 LDH的活性升高，MDA含量升高，S01)和GSH-Px活性降低。结论：雷公藤内酯醇对肝细胞具有明显的损伤作用且随 剂量增加具有一定的剂量依赖性，作用机制与其所致细胞脂质过氧化有关。 关键词：雷公藤；肝毒性；微载体粘附培养法 中药雷公藤是临床上使用频率较高的中药之一，因其活血化瘀、清热解毒、消肿散结、杀虫止 血等功效，被广泛应用于类风湿性关节炎、肾小球疾病、皮肤病及其他疾病的治疗【l’2’31。其有效成 分雷公藤内酯醇具有免疫调节、抑制细胞增殖、抗炎、抗生育、及抗肿瘤等生物活性【41。但随着雷 公藤广泛应用于临床，其毒副反应也日渐暴露出来，如肝毒性、肾毒性、生殖系统毒性等【5】，其所 致肝脏毒性在相关文献报道中居单味肝损伤中药的首位f67】，但其具体的肝毒性机制尚不完全清楚。 因此，本课题在建立肝细胞微载体粘附立体培养体系的基础上，观察雷公藤内酯醇对肝细胞的损伤 作用及机制。 l、实验材料 配制方法：用二甲基亚砜(DMSO)溶解为2mg／ml的母液，．20℃保存备用。 1．2 L02人工肝细胞株：由南京中医药大学中药药理毒理实验室馈赠。 1．3试剂：Cytodex．3微载体为GE 公司产品；DMEM、PBS、双抗、胰蛋白酶均为Gibco公司产品：胎牛血清购于杭州四季青生物工 过氧化物歧化酶(SOD)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；总谷胱甘肽过氧化物酶(GSH．Px) 检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。 HT。 产品，型号CKX31SF；酶标仪：美国Biolek公司产品，型号Synergy 2、实验方法 2．1细胞的培养【8】 2．1．1Cytodex．3的水化处理：取29 的PBS，室温放置4小时以上进行水化处理，用新鲜PBS清洗后高压灭菌备用。 用。 验室开放课题(T09004)、江苏省普通高校研究生科研创新计划资助。 163 min，3 养瓶中，同时将微载体按5mg．mL．1浓度加入细胞悬液中，每隔15rain用水浴恒温振荡器振荡5 h后改为每o．5h振荡5min，振荡至浮游单细胞数目减少，37℃恒温培养箱中培养，第2天开始视 培养液颜色决定是否换液及换液量(换液间隔为20．30h)。 2．2相关指标的测定：将生长状态良好的细胞用1640单培调成细胞悬液接种于六孔板，每孔2mL， 液中，空白对照组加入等量微载体，溶剂对照组加入等量DMSO，混匀，置孵箱培养24h后，分别 采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定；裂解细胞样品测定GSH．Px：采用碧云天生物技术研究 所试剂盒测定。 2．3统计学方法：采用OfficeExcel 2003软件进行数据统计。数据以x：ks表示，组间比较用t检验。 P0．05有统计学意义。 3、实验结果 3．1光镜下细胞形态观察 倒置显微镜下观察L02人肝细胞三维培养的细胞形态：刚加入微载体时，细胞和微载体均匀悬 浮于培养液中；加入微载体3h后，可观察到大部分细胞附着于微载体上并开始铺展，见图2；图3 中显示培养至第5天时，大部分微载体均包满细胞，并且微载体之间通过肝细胞连成片悬浮于培养 液中；第7天开始有部分细胞开始脱落。 3．2雷公藤内酯醇对肝细胞活性的影响 表l中结果显示：与空白对照组比较，雷公藤内酯醇1001ag／ml组肝细胞上清液的ALT、AST 高(P0．