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第三章 基因工程的常规技术 【教学时数】12小时 【教学目录与学时安排】 3.1 凝胶电泳技术（1小时） 3.1.1 琼脂糖凝胶电泳的原理 3.1.2 琼脂糖凝胶电泳的影响因素 3.2 杂交技术（3小时） 3.2.1 探针与探针标记 3.2.2 Southern杂交 3.2.3 Southern杂交 3.2.4 Western杂交 3.2.5 菌落 （嗜菌斑）原位杂交 3.3 PCR技术（2小时） 3.3.1 PCR技术的基本成分 3.3.2 PCR技术的原理和过程 3.3.3 荧光定量PCR 3.4 生物芯片（2小时） 3.4.1 DNA芯片 3.4.2 蛋白质芯片 3.5 基因文库构建（2小时） 3.5.1 基因组文库构建 3.5.2 cDNA文库的构建 3.6 酵母双杂交系统（1小时） 3.6.1 酵母双杂交系统的基本原理 3.6.2 酵母双杂交系统的应用 3.6.3 酵母双杂交系统存在的问题 3.7 DNA测序（1小时） 3.7.1 Sanger双脱氧链终止法 3.7.2 Maxam-Gilbert化学修饰法 【教学目的】 让学生掌握基因工程操作中常用的技术，包 常规技术生成原理，技术的应用范围，技术的缺 点等。使学生对基因工程的常规操作技术能够了解并且学会应用这些技术设计、分析实验过程。 【教学重点】 分子杂交技术，PCR技术，文库构建技术等等。 【教学难点】 Western blot, 生物芯片，酵母双杂交技术等等。 【教学方法】 多媒体演示与讲解，启发学生讨论相结合。 【教学过程与教学内容】： 前言：基因工程的操作过程 A DNA的体外重组（切、接） B 重组DNA分子的转化和扩增 （转、增） C 转化子的筛选和鉴定（检） 1. 重组率的概念： 重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75% 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。 2.转化率概念 转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受 体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规 下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子， 因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数 （在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）。 8 8 例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为10 ，即每微克pUC18中只有10 个分子能进入受体细胞。 11 17 一微克pUC18共有3.4X10 个分子 （6.02X10 / 2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有 一个分子进入受体细胞 10 另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X10 个大 肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA 。 转化率的影响因素： 载体及DNA重组分子方面： 载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同 插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。 受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低； 但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高 转化方法方面： 6 7 Ca2+诱导转化 10 - 10 / mg DNA 7 8 -DNA转染 10 - 10 / mg DNA 6 9 电穿孔转化 10 - 10 / mg DNA 3. 转化子的筛选和鉴定（检） （1）载体遗传标记检测 抗药性筛选法 显色筛选法 （2）DNA片段大小检测 限制性酶切图谱法：所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切 图谱分