运用实时荧光PCR与DNA芯片技术检测与鉴定食源性致病菌方法的研究.pdf

速用实时荧光?CR和D雠芯片技术检测和鉴定食溽性致病茸方法的研究 运用实时荧光PCR和DNA芯片技术检测和鉴定食源性致 病菌方法的研究 研究生：金大智 指导老师：谢明杰 曹际娟 专 业：细胞生物学 研完方向：微生物分子生物擘 摘要：食品中常见的致病菌是引起食物中毒的主要原因之一，可导致多种疾病的发生， 严重威胁着人们的健康，而且这些细菌大多数都难培养。目前，食品检验检疫工作中的 细菌鉴定仍然停留在生化水平上，少数用于PCR、免疫学、探针杂交等技术检测。快 速、准确的检测食品中的致病菌是有效预防和控制病原苗感染的前提条件。本文运用 在实时荧光PCR方法中，设计了小同的引物和探针可以特异的检测八种食源性致病菌， 分别是单增李氏菌、肠出血性犬肠杆菌0157：H7、副溶血性弧苗、沙rJ氏菌、空肠弯 曲菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、志贺氏菌。以单增李氏菌为例，建立了基因组DNA、细胞、 定量分子质粒三种标准曲线进行定量检测，检测的灵敏度可达10‘CFU／mL：并且运用实 时荧光RT—PCR技术将单增李氏菌的死活状态进行区分：同时．本文运用DNA芯片技术 建立了对常见食源性致病菌进行检测的方法，检测的目的菌株是雀乱弧凶、肠出血性 夫肠杆苗0157：H7、副溶血性弧凿、耶尔森氏凿、单增李氏菌、寓氏忐贺氏苗、鼠伤 rDNA、23SrDNA 寒沙门氏菌、空肠弯曲菌。致病菌的DNA分别通过自行设计的三对在16S 序列上的通用引物在同一条件F扩增后与DNA芯片上的探针杂交，通过杂交结果可以 看出设计的探针特异性强，并且相对于传统的方法操作简单、用时少，稳定性、重复 DNA芯片技术所建立的四种检测方法准确、可靠、实用性强。是检测食品 光RT—PCR录I 中常见致病苗技术水平的一次E跃。并且使用DNA芯片技术可一次实验搛作同时检测 6 运用实时荧光PCR和DM芯片技术拴测和鉴定食源性致病茸方法的研究 八种食源性磐病菌·本文所建立的四种检测食源性致病菌的方法为今后在食源性致病 菌检测、鎏瓷领域开展进一步的研究和更大规模的使用奠定可靠的理论与技术基础。 RT-PCR 关键词： 。实时荧光PCR DNA芯片 检测 食源性致病菌 7 运用卖时莞光PCR和D¨芯片技术检测和娄定食糠性致病茵方法的研究 文献综述 1．食品中常见致病菌及常规的检测技术 1．1食源性致病菌危害的严重性 食品是人类赖以生存和发展的物质基础．细菌导致的食源性疾病自然成为了人们 关注的焦点，世界上大多数国家都非常重视食品安全性问题。各国政府都采取了相应的 措施控制和检测食源性致病菌，并以立法的形式来确保食品的安全，但由于天然的食物 源生产的全球化、新的食品生产工艺的应用、人们饮食习惯的改变等各种冈紊在一定 程度上降低了食品的安全性。据权威资料报道，病原微生物引起的食源性疾病是影响 食品安全的最主要的因素之一…。近年来，在世界范围内食品安全方血的恶性、突发 性事件屡屡发生。继犬规模发生丁日本、欧洲、美国的人肠杆菌0157：H7食物中毒后． 欧洲和日本义出现了牛海绵状脑病(BSE，俗称疯牛病)，法国出现了李斯特氏菌的疾 病“【，香港出现了禽流感．比利时出现了_二嘧英，以及具有多重抗药性的鼠伤寒沙门 氏菌在多国的流行等l”。其中有的引起大最急性发病乃至死亡：据不完全统计，1999 年美国暴发了由冰激凌污染造成的沙门氏菌疾病估计有22400人患病：2000年全球有 210万人死于腹泻，大部分归因于食物和饮用水中致病菌的污染”1；全球每年约有14000 例忠贺氏菡病，估计发病人数达30万。1976年在美国纽约暴发过一起耶尔森氏菌导致 引起的食源性疾病人暴发已达七次；J二业化国家每年患食源