最牛最全面的单克隆抗体制备技术.docVIP

单克隆抗体制备技术 一、实验原理 B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种 B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的 B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 制备单克隆抗体的方法是用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤细胞变异株与脾脏的 B细胞融合。采用 HAT选择性培养基（hypoxanthine-aminopterin-thymidine次黄嘌呤氨基喋呤胸腺嘧啶），在这种选择性培养基中，由于变异的瘤细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用培养基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成 DNA。而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成 DNA，这一途径又被氨基喋呤所阻断，所以未融合的瘤细胞不可避免也要死亡。融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过次黄嘌呤合成 DNA，克服氨基喋呤的阻断，因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。B淋巴细胞在一般培养基中不能长期生长，一般于二周内均死亡。 单克隆抗体与常规抗体相比有如下优点：①单一特异性，与一个抗原决定簇反应；②可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂；③一经制出，可无限量地供应；④生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原；⑤能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。 二、实验材料 1。主要仪器 CO2培养箱、台式离心机、倒置显微镜、倒置荧光显微镜、酶标仪、电热恒温水浴箱、超纯水系统、超净工作台、核酸电泳仪、SDS电泳仪、Western Blotting转膜仪、凝胶成像系统等。 2．主要试剂 HAT培养基（购自Sigma公司）、HT培养基（购自Sigma公司）、RPMI1640培养基（购自GIBCO公司）、羊抗鼠IgG-HRP抗体（购自Sigma公司）、羊抗鼠IgG-FITC抗体（购自Sigma公司）、胎牛血清（购自GIBCO公司）、DMSO（购自Sigma公司）、50%PEG（购自Sigma公司）、DMEM培养基（购自GIBCO公司）等。 3。实验动物 6-8周龄Babl/c小鼠，SPF级，购自湖北省疾病预防和控制中心或武汉大学中南医院实验动物中心。 三、操作程序 以下为单克隆抗体制备的操作过程，值得注意的地方用小字体标出 1、动物免疫 首先，取适量抗原(约100ug)与等体积的佛氏完全佐剂乳化，免疫动物为4-6周龄的雌性BALB/c鼠。 免疫方案及程序为:背部皮下注射佛氏完全佐剂乳化的抗原100ug/只;2周后换用不完全佐剂乳化等量抗原，背部皮下注射;间隔至少1个月后，三免,200ug/只;在融合前三天通过脾内、尾静脉注射进行加强免疫，抗原量为200-300ug/只（一般为100ug，如果抗原量过大的话，小鼠可能会发生应激死亡），不加佐剂。 2、SP2/0骨髓瘤细胞的活化 骨髓瘤细胞的复苏: 从液氮罐中取出骨髓瘤细胞冻存管,放入37℃水浴锅中至完全融化;1000r/min离心3-5min;倒弃上清液,用营养液(RPMI-1640,小牛血清的浓度在10%-20%)将下沉的细胞吹散悬浮后加入有适量营养液的细胞培养瓶中,置5%CO2 37℃培养箱培养;次日观察骨髓瘤细胞的生长情况,如为圆形,透亮,呈轻微贴壁生长,则说明骨髓瘤细胞生长良好,如发现有些细胞发暗,漂浮于液体中,则可以换液,弃去漂浮的死亡细胞,此时存活的细胞大部分可贴壁生长并增殖.培养3-5d后进行细胞传代,扩大培养. 将细胞板中培养的SP2/0细胞，收集起来用0.5ml1640基础液悬浮.(0.5~1*106个)注射BALB/c小鼠背部皮下。待9~10d瘤子生长后，视大小选择取瘤细胞的时间。 3、细胞融合 一般在免疫小鼠加强免疫后3～5天做细胞融合结果比较好。 在融合之前应将PEG、40ml终止液（基础1640）和HAT培养基放入37℃温箱预热备用。 三种细胞的制备方法如下，结合以往做的经验，一般分离的顺序为：首先制备SP2/0瘤细胞，然后制备饲养细胞，最后制备免疫脾细胞。 3.1 SP2/0瘤细胞的制备 从小鼠背部生长的瘤子中制备的方法如下: 1．小鼠拉颈处死，75%酒精浸泡5min,超净台无菌状态取瘤； 2．先将肿瘤块剪下，放于匀浆器中，加5ml1640基础液充分研磨后，补加10ml1640液，静置2min，待较大的组织团块沉于管底后，吸取上层的细胞悬液于另一离心管备用，再补加10ml1640液，重复