第十二章荧光分析法.pptVIP

荧光分析法 荧光分析法 荧光分析的基本原理 荧光定量分析方法 荧光分析仪器与技术 荧光分析法概述 荧光分析法与紫外-可见分光光度法的主要区别 荧光分析法的基本原理 单重态与三重态 激发态分子返回基态的途径 激发态→基态途径（图） 振动弛豫 内部能量转换（内转换） 外部能量转换（外转换） 体系间跨越 荧光和磷光的主要区别 激发光谱与发射（荧光）光谱 硫酸奎宁的激发光谱及荧光光谱 荧光光谱的特征 荧光光谱与激发光谱呈镜像关系 蒽的能级跃迁 荧光寿命和荧光效率 荧光寿命(fluorescence lift time,?f)：当激发光停止照射时，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1/e所需的时间。 荧光效率(fluorescence efficiency) 荧光量子产率(fluorescence quantum yield) 物质分子能发射荧光的两个必要条件 有机化合物分子结构与荧光的关系 长共轭结构 分子的刚性和共平面性 取代基 影响荧光强度的外界因素 荧光熄灭剂 引起荧光熄灭的原因 硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与拉曼光谱(b) 荧光定量分析 荧光强度F与浓度C的关系 荧光定量分析的依据 荧光分析法与UV-vis灵敏度差异 荧光定量分析方法 比例法 荧光分析仪器与技术 荧光分析仪器类型 930型荧光计光路示意图 荧光分光光度计 荧光分析仪器的主要部件 荧光分析仪器的校正 荧光分光光度计与紫外分光光度计的区别 荧光分析新技术 同步荧光分析 荧光分析的应用 有机化合物的荧光分析 荧光试剂 邻苯二甲醛(OPA) 无机化合物的荧光分析 本章重点内容小结 [课后练习] 溶液的荧光测定 激发光源垂直方向 荧光测定方向：激发光源垂直方向，避免透射光干扰。 F=K?(I0–I) (I=I010-ECl) =K?(I0-I010-ECl) =K?I0(1-10-ECl) =K?I0(1-e-2.3ECl) 太劳极数展开式： ex=1+x/1！+x2/2！+x3/3！+…… ECl≤0.05 F=2.3K?I0ECl =KC 荧光分析法仅适用于稀溶液的测定 满足定量分析条件： ECl≤0.05→F∝C 降低荧光自熄灭（内部猝灭）作用 灵敏度高（放大信号） F与C的关系推导（续前） ? 紫外-可见分光光度法定量依据：A∝C 检测信号：A=-lg(I/I0)=ECl C↓→I0/I≈1→A≈0 荧光分析法定量依据：F∝I0及C 检测信号：F=2.3K?I0ECl C↓→F↓ →放大信号（检测灵敏度↑ ） → I0↑→F↑→荧光分析灵敏度高 →放大信号→I0↑，I↑ →I/I0不变→UV-vis灵敏度受限，不如荧光分析 (S=10-6~10-7g/ml) (S=10-9~10-12g/ml) ? 校正曲线法(F~C) 荧光分析法与UV-vis定量测定时仪器校正的区别 荧光分析法 UV-vis 100% 0 T=0，A=∞ 关闭光闸，光不透过，全吸收 T=100%，A=0 空白溶液，光全透过，不吸收 F=0 空白溶液，不发射荧光 F=100% 对照品溶液Cmax F=50%(Cmid) 荧光定量分析方法（续前） 适用：校正曲线过原点 多组分混合物测定 原理：荧光强度的加和性 方法：解联立方程 空白调零降低测定的灵敏度：仪器调零→ F0→Fs和Fx→扣除空白(Fs-F0、Fx-F0)计算。 荧光分析仪器类型、主要部件和校正 荧光分析新技术 荧光分析的应用 滤光片荧光计 分光系统：激发滤光片（带通型） 发射滤光片（截止型） 用途：可用于定量分析；不能测定光谱 滤光片-单色器荧光计 分光系统：激发滤光片+发射光栅 用途：可用于测定荧光光谱及定量分析；不能测定激发光谱， ? 激发滤光片 发射滤光片 荧光分析仪器类型（续前） ? 荧光分光光度计结构示意图 分光系统：光栅 用途：测定激发光谱、荧光光谱及定量分析。 最大激发波长?exmax和最大荧光波长?emmax是鉴定物质的依据和定量测定时最灵敏的条件。 激发单色器 发射单色器 荧光分析仪器类型（续前） 激发光源：汞灯、氙灯、氘灯、溴钨灯 分光系统：滤光片；单色器（光栅） 样器池：低荧光材料或石英材料，四面透光 检测器：紫外-可见（光电倍增管） 灵敏度校正：对照品溶液Cmax →F=100% Cmid →F=50% 硫酸喹啉: 0.001g喹啉标准品→硫酸(0.05mol/L) →C=1?g/ml 波长校正：汞灯标准谱线 激发光