介微分析一部分填充毛细管电泳法测定黄嘌呤氧化酶的活性.pdfVIP

全国生物医药色谱学术交流会(2008)论文集 C35介微分析一部分填充毛细管电泳法测定 黄嘌呤氧化酶的活性 张礼春李向堂赵书林术 广西师范大学化学化工学院桂林541004 黄嘌呤氧化酶(XanthingOxidase，简称XOD)是人体内嘌呤代谢过程中的一种重要的酶， 是尿酸生成的关键酶。XOD是含钼蛋白酶，主要生化作用是催化次黄嘌呤及黄嘌呤生成尿酸 同时产生大量的Oz1和H202等活性氧【l】。体内XOD活性异常增高是体液尿酸浓度过商而引 发高尿酸血症和通风的一个主要机制。因此，XOD是高尿酸血症和通风的良好治疗靶点，研 究XOD活性显然和XOD抑制剂筛选一样具有重要意义。 目前，测定黄嘌呤氧化酶活性的主要有NBT／PMS比色法【2J、MTS／PMS比色法、紫外分 光光度法、电化学法、放射化学法【3’41、反相高效液相色谱法【5】等方法，而高效毛细管电泳法 测定黄嘌呤氧化酶活性还未见报道。 本文采用胶束电动色谱法分离黄嘌呤氧化酶体系中黄嘌呤、尿酸和酶三种组分，并通过 测定产物尿酸的峰面积进行定量分析，建立了以中介微分柝(EMMA)【61与部分填充毛细管 电泳技术结合分析黄嘌岭氧化酶活性的新方法。 1．仪器与试剂 cm，有效 lip3D型高效毛细管屯泳仪(美国Agilent公司)；未涂层石英毛细管，总长34，5 长度26cm，内径50|lm(河北永年锐沣色谱器件有限公司)；PHSJ一4A计(上海精密科学仪器 有限公司)；TU一1901双光束紫外可见光分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。 黄嘌岭氧化酶(Xanthine U．m／d)i黄嘌呤(Xanthine， Oxidase，美国Sigma公司，0，67 州化学试剂厂)。实验过程中所用化学试剂除特殊说明外，均为分析纯。试验用水均为亚沸水， 实验所用的溶液均经过0．45 lam纤维膜过滤。 2．EMMA法操作步骤 mmol·U1含15mmol-U1 8,0的25 SDS的硼砂 在酶和底物区带进入毛细管之前，先用pH 缓冲液作为背景电解质冲洗毛细管3min。为了防止区带与区带之间的相互渗透，首先以20 mbar5 mbar5 8．0的25mmol-L．1的硼砂缓冲液区带。然后，在20S下，依次将酶溶 S进pH 液、酶反应缓冲液、底物溶液、酶反应缓冲液和背景电解质溶液引入毛细管。在每次进样之 前，先让毛细管进样端和电极在水中浸泡一段时间以免相互受到污染。然后，在lkv的电压 下使试样带之间相互混合20S，最后采用15kV的电压进行酶、底物和产物的分离。 3．黄嘌呤和尿酸特征吸收波长的确定 rim有最大特征吸收峰， 由紫外扫描光谱可知．黄嘌呤和尿酸的吸收峰较近，尿酸在295 在实验中主要是以尿酸的峰面积进行定量分析，因此以295nm作为毛细管电泳的检测波长。 4．毛细管电泳分离条件 155 全国生物医药色谱学术交流会(2008)论文集 8．025mmol·L．1 分别试验了pH 8．0的25mmol·L．1 液，结果发现pH NaB407一HC!缓冲液可以实现底物和产物的基线分离，所 以选择硼砂缓冲液。 经过一系列条件实验确定了黄嘌呤氧化酶反应混合物分离的最佳电泳条件为：硼砂缓冲 mmol·L_1，进样压力20mbar，进样时间5s，分离电压15l(v，检 液的pH值8．0，