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实 验 三 过氧化氢酶活性的测定 ——碘量法 生物体内重要的三种氧化酶类，其作用均是清除体内自由基： POD：过氧化物酶 SOD：超氧化物歧化酶 CAT：过氧化氢酶 一、实验目的： 1、掌握碘量法测定过氧化氢酶活性的原理和方法； 2、了解过氧化氢酶的作用。 二、实验原理: 植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可进一步生成氢氧自由基（OH˙）。 氢氧自由基（OH˙）是化学性质最活泼的活性氧，可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并且有非常高的速度常数，破坏性极强，可使细胞膜遭受损害，加速细胞的衰老和解体。 过氧化氢酶(catalase；CAT)可以清除H2O2、分解氢氧自由基，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活，因此CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的抗逆性密切相关。 二、实验原理: CAT活性大小以一定时间内分解的H2O2量来表示： 在一定条件下，CAT能把H2O2分解为H2O和O2。当CAT与H2O2反应一定时间(t)后，再用碘量法测定未分解的H2O2，以钼酸铵作催化剂，H2O2与KI反应，放出游离碘，然后用硫代硫酸钠滴定碘，反应式为： H2O2（余）+2KI+H2SO4----→I2+K2SO4+2H2O I2 +2Na2S2O3 --→2NaI+Na2S4O6（连二硫酸钠） 用硫代硫酸钠分别滴定空白液(可求出总的H2O2量)和反应液(可求出未分解的H2O2量)，再根据二者滴定值之差求出分解的H2O2量。 三、实验材料、仪器和试剂： 1、实验材料：三叶草 2、仪器： (1) 滴定管 (2)研钵 (3) 容量瓶 (4)移液管 (5)三角瓶(100ml) 3、试剂： （1）0.05M H2O2 （2）0.2M Na2S2O3 （3）1.8M H2SO4 （4）1.5%淀粉溶液 （5）10%（NH4)6Mo7O24 （6）20% KI （7）CaCO3-，石英砂 四、实验步骤： 1、酶液提取： 称取0.5g三叶草，加少量石英砂，CaCO3，2ml水，研成匀浆，移入50ml容量瓶，冲洗研钵数次，定容，静置，过滤。 2、酶促反应： （1）取锥形瓶2个，编号A，B，各加入10ml酶液，之后立即向A瓶中加入1.8mol/L H2SO45ml，终止酶活性，作空白滴定。 （2）向A，B两瓶各加H2O2 5ml，摇匀，在加入B瓶那一刻起，记录 时间，5分钟后迅速向B瓶中加入1.8mol/LH2SO45ml，终止酶活性。 3、滴定： ? 向A，B两瓶各加1ml 20% KI和3滴（NH4）6Mo7O24，摇匀后迅速加入5滴1.5%淀粉溶液，用Na2S2O3进行滴定至蓝色恰好消失，记录两次消耗Na2S2O3的体积VA(空白)，VB(反应液)。 酶活性测定 五、实验结果与计算： 1、被分解的H2O2量（mg） = （空白滴定值-样品滴定值）×Na2S2O3摩尔浓度×17 2、CAT活性（mg.g-1.min-1）= 被分解的H2O2量（mg）×(总体积÷测定取液量) 样品重（g）×时间（min） * 学时：3 VB(反应液) = 5 3 1 5 5 - 10 B 反应 VA(空白) = 5 3 1 - 5 分钟 5 5 10 A 空白 0.2M Na2S2O3溶液的滴定量 淀粉溶液(滴) 钼酸铵溶液(滴) 20% KI溶液(ml) 1.8M H2SO4 (ml) 保温 0.05MH2O2 1.8M H2SO4 (ml) 酶液 (ml) 管号 六、思考题： 1、本实验中影响CAT活性测定的因素有哪些？