2012转氨基作用.pptVIP

纸层析法观察转氨基作用 王 继 红 实验目的 1、 学习层析技术 2、 掌握氨基酸纸层析 法的基本原理 层析技术 层析技术的基本原理 纸层析的分离原理 纸层析是分配层析，是利用混合物在二种或者二种以上的溶剂中总分配系数的不同而使物质分离的方法。 纸层析原理 以滤纸为支持物，滤纸上纤维为载体，滤纸上结合水为固定相，有机溶剂(酚：水 = 8：2)作为流动相。 滤纸纤维与水亲合力强，能吸收20-22%的水，且其中6-7%的水是以氢键形式与纤维素的羟基结合，在一般情况下很难脱去，而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力甚弱。 纸层析法分类 按操作方式分成两类：垂直型和水平型。顾名思义垂直型是将滤纸条垂直悬挂，使流动相向上或者向下扩散。水平型是将圆形滤纸置于水平位置，使流动相溶剂由中心向四周扩散。 纸色谱法 本实验原理 转氨基反应是由专一转氨酶催化的α-氨基与α-酮酸之间基团互换反应, 广泛存在于机体各组织器官，是体内氨基酸代谢的重要途径。 实验原理 本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，加含有谷丙转氨酶（ALT）的肝匀浆，保温后用纸层析法检查谷氨酸的出现，以证明转氨基作用。 ALT催化的转氨基反应 实验原理 本实验设立实验组和对照组。实验组反应结束后体系中存在两种氨基酸，说明发生了转氨基作用，而对照组体系中存在仅有一种氨基酸，说明没有发生转氨基作用（由于煮沸使肝匀浆中ALT失活）。 实验原理 在本实验中由于丙氨酸和谷氨酸在酚和水二相中的分配系数不同，各有自己特定的迁移率。极性弱的丙氨酸易溶于有机溶剂酚中，在水中分配系数小，随流动相移动较快，而极性强的谷氨酸则相反，最终彼此分离。 比移率Rf计算 衡量被分离物质在滤纸上的移动速率用比移率Rf表示： 【器材】 匀浆器、水浴锅、恒温水浴箱、圆滤纸(9cm)、吹风机、组织剪刀 离心管、试管、培养皿、表面皿、等 【试剂】 1．磷酸盐缓冲液 2．0.2mol/L 丙氨酸溶液 3．0.1mol/L α－酮戊二酸溶液 4．0.1mol/L 谷氨酸溶液 5．0.5% 茚三酮溶液 6．层析溶剂 酚饱和水(8:2)溶液 实验步骤 【实验步骤】 1．匀浆制备 2．酶促反应过程 （1）取离心管两支，编号：测定管、对照管。各管加肝匀浆10滴。测定管于37℃水浴10min，对照管放沸水浴中加热10min，取出冷却。 【实验步骤】 【实验步骤】 （3）测定管取出后立即放沸水浴中煮 10min(终止反应)，取出后冷却， 过滤，滤液备用。 3．层析 取直径9cm圆形滤纸一张，用圆规作半径1cm同心圆，通过圆心做两条相互垂直的线，找到4个位点。 层析纸准备 在滤纸圆心处打一小孔，取滤纸一条，下半剪成须状，卷成灯芯状捻, 上端插入滤纸中心孔中（不要突出滤纸面）。 点样 用毛细管在纸上1、3处分别点测定和对照管上清液(斑点直径约0.5cm)，2、4处各点丙氨酸和谷氨酸溶液。 层析 把滤纸平放在盛有层析液的培养皿上，使纸芯下浸入层析液中，可见酚液沿纸芯上升到滤纸中心，渐向四周扩散，盖上培养皿盖。 当酚液前缘到离滤纸边缘约1cm时（约25-30分钟）取出滤纸，用镊子小心取下纸芯，在烤箱中烘吹干滤纸。 4 、显色 在层析滤纸上滴0.5 %茚三酮溶液,在烤箱中烘吹干滤纸,可见同心弧状色斑。 用铅笔圈下各色斑, 计算各色斑的Rf值，分析是否发生了转氨基反应。 注意事项 1．点样时手要洗净，操作中手尽可 能少接触滤纸，以免污染。 2. 点样点不宜过大，直径应小于 0.5cm，为什么？ 3. 层析液有腐蚀性，操作时注意安 全，防止溅到皮肤或者眼睛。 * * P、63 生物化学实验 层析法又称色谱法，是一种根据混合物的物理或化学性质不同（如吸附力、溶解度等）而建立的物质分离、分析方法，是近代生化最常用技术之一。 在层析系统(固定相＋流动相)中，由于混合物各组份理化性质不同，与两相的相互作用（吸附、溶解等）能力不同，随着流动相不断向前移动，不同组分最终得以分开 不同物质的Rf不同,经计算可分析是否发生了转氨基反应! 准备滤纸→点样→层析→终止→染色→分析结果 测定管上清液 0.1 mol/L丙氨酸 对照管上清液 0.1 mol/L谷氨酸 （2）各管加丙氨酸溶液10滴, α-酮戊二酸10滴, 磷酸盐缓冲液1.5 ml, 摇匀，置 37℃保温30min，取出。 *