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单克隆抗体的制备及其应用 生物21001班 赵梦莹 1014151004 摘要：单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具,在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着的作用近年来,随着分子生物学技术的发展,这些技术将有效解决单克隆抗体的鼠源性等问题。1975年德国科学家Kohler和英国科学家Milstein利用杂交瘤技术将产生抗体的B淋巴细胞同骨髓瘤细胞融合，成功的建立了单克隆抗体制备技术。由于单克隆抗体在生命科学领域的巨大贡献，此技术获得1984年的诺贝尔医学和生理学奖。此后单克隆抗体迅速广泛地应用于生物学和医学的各个领域。 1 单克隆抗体的种类及制备 1.1 鼠源性抗体 1975 年，Kohler和Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经绵阳红细胞免疫的小鼠脾细胞融合，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞既能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。由免疫B细胞-浆细胞、瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞系可分泌单一、特异性、纯化的抗体，且能在选择培养基中生长、无限增值、分裂，同时在选择培养基作用下，利用代谢缺陷补救机理筛选出同时具有两种细胞特征的细胞克隆。这种经过反复克隆而挑选出来的融合细胞所产生的抗体称为单克隆抗体。它在分子结构、氨基酸序列以及特异性等方面都是一致的。淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等。至今，科学家们已经建立众多鼠源性mAbs 来诊断和治疗多种人类疾病。然而作为在人体内的应用，鼠源单抗尚存在一些问题。鼠源性抗体作为异种蛋白应用于人体可引起免疫反应，产生人抗鼠抗体，很大程度上限制了mAbs 的临床应用。此外，鼠源性mAbs不能与人类抗体FcRn结合。为了克服以上这些问题，近年，随着分子生物学的发展，人们已有可能通过抗体工程技术制备人-鼠嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。 1.2 人-鼠嵌合抗体 嵌合抗体指的是鼠mAbs的恒定区基因被人Abs的恒定区基因通过基因重组技术所替换而编码产生的单克隆抗体。这样既能保持鼠单抗的特性，又使获得的单抗降低了在人体内的免疫反应。Jones等在20世纪80年代中期首次成功构建了小鼠抗半抗原-4-羟基-3-硝基苯乙酰基己酸的免疫球蛋白VH基因， 并最终获得可特异结合NP的人源化嵌合抗体， 再通过定点突变法进行单纯的CDR移植构建，形成第一代人源化抗体。随后还相继研发了阿昔单抗、美罗华等嵌合抗体，现均已被广泛应用于科学研究与疾病诊断之中。CDR 移植抗体，又称改型抗体，它是在嵌合抗体的基础上，利用基因工程技术，进一步用人的FR 代替鼠FR，形成的只剩3个鼠源CDR 的更为完全的人源化抗体。由于具有支持作用的FR 不仅为CDR 的构想提供了环境，还参与抗体结合位点正确构像的形成和抗原的结合，常常使得CDR移植抗体的亲和力和特异性大大降低，有的甚至还丧失了抗原结合能力。 1.3 人源性抗体 为了能使单克隆抗体大量的应用于疾病治疗、临床试验和科研中，我们不仅要降低其免疫原性，还要对其亲和力质量、治疗能力强弱等方面提更高的要求。目前，研究人员已建立多种方法生产完全人源性抗体，主要有噬菌体展示技术和转基因小鼠技术。 1.3.1 噬菌体展示技术 噬菌体展示技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来，从而得到全套的噬菌体库。噬菌体展示首先是通过大肠杆菌特异性的噬菌体发展起来。迄今为止，已建立的噬菌体展示系统，如丝状噬菌体、l噬菌体、T4噬菌体、T7 噬菌体和真核病毒系统等。此外多肽还被展示在细菌及酵母的表面。虽然这些不同展示系统的优点在特殊应用中得到了证明，但都是基于丝状噬菌体M13和噬菌粒相互作用之上。噬菌体展示的基本原理是将抗体重链可变区和轻链可变区基因通过基因工程技术随机插入噬菌体的外壳蛋白基因，继而感染大肠杆菌，经增殖并以抗体片段Fab或ScFv外壳蛋白融合蛋白的形式展示在噬菌体表面；利用靶分子，经过“亲和-洗脱-扩增-亲和”循环过程筛选，除去杂蛋白并富集特异性抗体。在噬菌体表面所展示的是随机肽段或蛋白质的抗体库称为全套抗体库，从中筛选到的抗体称为噬菌体抗体，它的最大特点是实现了直接将基因型和表型完美的结合在一起，可以快速而高效地从大量克隆筛选出表达特异性的抗体。至今，由这一技术产生的抗体至少有14个已用于临床试验中。然而，它还存在着如未经免疫获得的抗体亲和力相对较弱，抗体库的库容无法涵盖一些动物的抗体多样性等缺点，因此，大容量抗体库的亲和力和抗体多样性问题将是我们今后研究抗体库技术所必须考虑的关键。 1.3.2 转基因小鼠技术 该技术是将人抗体基因微位点转入小鼠体内，产生能分泌人抗体的转基因小鼠。1998年，Green等将人抗体轻重链基因