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硝化细菌分离与鉴定 硝化细菌-一类专性化能自养（无机营养）细菌，包括亚硝化菌和硝化细菌两个菌群，一般种类不能生长在有机培养基中。在有氧的条件下，亚硝化细菌群将氨氮转化亚硝酸氮，硝化细菌群将亚硝酸氮转化硝酸氮，两者常生长在一起。 硝化细菌分离比较困难，由于它生长缓慢，平均代时10-20h以上，且不同菌株间差异较大。 1.硝化细菌分离： 1.1分离材料：氨场周围的土壤 池塘或污水出水口污泥 1.2培养基： 1.2.1富集培养基： 亚硝化细菌培养基： 1）硫酸铵5g/l 磷酸二氢钾0.7g/l 硫酸镁0.5g/l 氯化钙0.5g/l 用5％碳酸钠调PH8.0 （硝化细菌用亚硝酸钾2 g/l代替硫酸铵5g/l） 2）硫酸铵2g/l 氯化钠0.3g/l 硫酸亚铁0.03g/l磷酸氢二钾1.0g/l 硫酸镁0.03g/l 碳酸氢钠1.6g/l PH7.5-8.0 1.2.2分离培养基： 亚硝化细菌培养基： 甲液：硫酸铵11.0g 硫酸镁1.4g硫酸亚铁0.3g蒸馏水100ml 乙液：磷酸二氢钾1.36g 蒸馏水100ml 甲：乙=9:1 PH8.0-8.2 硝化细菌培养基： 硫酸铵2.0g磷酸氢二钾1.0g/l硫酸镁0.5g/l氯化钠2.0g/l硫酸亚铁0.4g/l碳酸钙5.0g/l PH7.5-8.0 用亚硝酸钾2.5 g代替硫酸铵11.0g。为增加硝化细菌的分离效果，在培养液中添加1％粉状碳酸钙和0.04ml/100ml微量元素溶液。 1.2.3BPY(肉膏蛋白胨酵母膏培养基) 牛肉膏5g/l 酵母膏5g/l 蛋白胨10g/l 氯化钠5g/l 葡萄糖5g/l PH7.0 （检查硝化细菌纯度用） 1.3富集培养： 取泥样1.0g或1.0ml活性污泥接入30ml/250ml三角瓶或10ml/18x180mm试管中，28-30℃130r/min震荡培养，每隔几天用格利斯试剂在白瓷板上检验亚硝酸根的生成，培养7-8d后培养液遇格利斯试剂呈红色，表明有亚硝酸盐存在。或检测硝酸根的存在，用二苯胺试剂遇培养液呈蓝色，说明有硝化细菌存在，表明亚硝酸氮氧化成硝酸氮。用显色深浅判断作用强弱，选出作用强的试管，吸两滴培养液接入新鲜培养液的试管（或1.0ml于30ml/250ml三角瓶）中，继续培养并用同样方法测试，经几次反复操作不断淘汰其他异氧菌，在连续转管时补加亚硝酸钠，增加培养硝化细菌的数量。 1.4分离培养： 1.4.1平板制作： 硅胶平板： 稀酸液制备：蒸馏水140 ml，加浓硫酸（比重1.84）5ml，蒸馏水170 ml，加浓盐酸（比重1.19）20ml，两者混合均匀。 水玻璃制备：硅酸钠51.7g，加蒸馏水313 ml溶解而成。 稀酸液：水玻璃=2:1混合，几分钟后，就形成乳白色的硅胶板，放入水槽用流水浸洗至氯离子消除（用1％硝酸银检查浸洗水），用开水浸洗几次，无菌水洗几次，倒置稍干。 培养平板制备：每个平皿需加分离培养基2.0ml作为菌培养液和5％硫酸铵溶液1ml，轻轻转动平板皿，使培养液分布均匀，打开皿盖，置于50-60℃温箱中，烘至表面无营养液流动为止。 水洗洋菜平板： 市售洋菜在蒸馏水中浸泡2-3d，再用蒸馏水冲洗3-5次，直到洋菜呈白色透明，烘干待用。以2％的水洗洋菜制备培养基，高压灭菌降至45-50℃后倒入培养皿，成水洗洋菜平板。 1.4.2分离培养： 分离前将富集培养液通二氧化碳或氮气30min，取0.1-0.2ml富集菌液滴入3-5个平板均匀涂布或划线，28-30℃培养，水洗洋菜平板1-2周，硅胶平板2-3周，为防止水分蒸发，避免平板干裂，倒置于盛有少量的水的干燥器中培养。当长出针状大小的菌落时，挑取10-15个菌落，分别接种于富集培养液中，经液体培养检验，在继续重复涂布，反复几次得到单菌株。 水洗洋菜平板上出现清亮的浅白色细小的菌落，硅胶平板上分离的菌落浅黄色。通过多次分离试验，两平板均较好的分离硝化菌和亚硝化菌。 注：光照对光合细菌的生长不利。 讨论： 补加亚硝酸钠对比：在硝化细菌的加富培养中，重复数次培养，向培养液补加亚硝酸钠。 有效抑制杂菌生长，硝化菌数量增多，加过试剂的培养液颜色较深。 补加 不补加 格利斯试剂反应： 深红色或棕红色 浅红或粉红色 水洗洋菜平板 数量多，560个 数量少210个 菌落分离情况： 硅胶平