离子交换法分离纯化脱落酸地研究.pdfVIP

离子交换法分离纯化脱落酸的研究 马东慎 郑珩 顾觉奋 中国药科大学生命科学与技术学院，南京210009 脱落酸为五大内源植物激素之一，具有促进种子、果实贮藏物质的积累，抑制种子萌发、 提高作物产量及抗旱与耐盐力、促进气孔关闭、器官衰老脱落等作用。研究发现脱落酸还是 哺乳动物体内的一种信号传导分子。人与动物的多种组织和细胞或受刺激时能够产生并释放 ABA，对于免疫系统、心血肝组织、干细胞以及胰腺有调节作用。鉴于对脱落酸的研究越 来越受到重视，因而其发酵生产、分离纯化的研究至关重要。 兰州2012年7月21．23日 在动态洗脱条件中，设计了不同洗脱流速梯度以筛选出最佳洗脱流速。实验表明， 0．5mUmin的洗脱峰最为集中，洗脱率达98．07％。设计3个洗脱流速，分别为O．5mL／mill、 lmL／miIl、3mL／miIl。将吸附了ABA的树脂装入层析柱中，用恒流泵固定流速，进行洗脱实 验。以累计洗脱体积为横坐标，洗脱液中ABA浓度为纵坐标绘制洗脱动力学曲线(图2)。 选择了最佳洗脱剂浓度时发现：1．2mol，L洗脱剂的洗脱峰比较集巾，其洗脱率为98．07％， 高于其他浓度洗脱剂。因此选择1．2mol／L洗脱剂作为最佳洗脱剂浓度与静态实验结果吻合。 2．放大实验、浓缩精制及工艺路线的确定 对实验设计的路线进行10倍放大，即动态洗脱树脂量为20mL。将饱和后的树脂装入 进行洗涤，以1．2m01／L，乙酸，O．5mL／mm的流速进行洗脱，共计洗脱220mL。测得洗脱液中 蒸发浓缩至油状物后以石油醚于50℃溶解，加活性炭脱色趁热抽滤，置于室温中获得晶体。 以石油醚霞结晶后于4℃冰箱中结晶过夜，获得精制后的ABA。以P205真空干燥，得 114．39mg终产品。取18．34mg干燥晶体溶于lOmLHPLC流动相中，测得浓度为1．673mg／mL， 共含有16．73mgABA，得ABA终产品纯度为91．22％。放大试验证明该法是从发酵物中分离 纯化ABA快速、简便、高效的方法。建立分离纯化路线操作步骤如下： 【预处理1 【吸附】 发酵产物——————————．． 上样液——————◆ 饱和树脂 80％丙酮抽提．1，5体积 D30l弱碱性阴离子 EA萃取，旋蒸浓缩，去离 交换树脂吸附 【洗涤、洗脱】子水溶解 【精制】 —————————+ 粗品 ，． 精品 O·lmol／L HAc洗涤，EA萃取．旋蒸浓缩．石油 1·2mol／L HAc洗脱 醚重结，P205真空干燥 流速为O．5mUmiII 3．1口LC检测发酵产物、中间体和产品中柚认含量 ． 通过HPLC法测得发酵产物、中间体及终产品纯度如表l。终产品HPLC报告见图3。 1ab．1 in Purit)，ofABAfe彻entatioll， mediate锄d pureproduct 样品(s矾ple) 纯度(％)(purity) ABA对照品 99．5 发酵产物 69．OO 中问体 90．25 精品 91．22 Fi蛋3111e唧LCr印ortoftllepl腓pmduct 4．结论 本文对从葡萄厌孢霉菌发酵产物中分离纯化脱落酸的方法进行了研究。对7种弱碱性阴 ·14· 第16届反应性高分子学术讨论会 初筛、复筛确定D30l为最佳树脂。在静态下确定最佳上样pH3．5、1．2mol／L乙酸为最佳洗 脱剂。在动态条件下进行洗脱