2011下新实验讲义(横).docVIP

分子生物学实验讲义 有关实验报告的书写（实验报告要求当堂上交） 1、封面： 分子生物学实验报告 班级 姓名 学号 2、内容： 实验的名称，如： 实验一、DNA的分离纯化 实验目的 实验原理 实验用品 实验步骤 试验结果 实验一、DNA的分离纯化 -------碱裂解法提取质粒DNA 实验目的： 掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理与方法，了解各种试剂的作用。 实验原理： 从细菌分离质粒DNA的方法都包含3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。碱变性法抽提质粒是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。NaOH- SDS溶液处理，可破坏菌体细胞壁细胞膜。NaOH细菌染色体DNA但质粒超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，所以当以pH4.8的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。线状染色体DNA片段难以复性，与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物氯仿/异戊醇试剂: ???溶液Ｉ葡萄糖维持渗透压、Tris－HCl?维持pH?值、EDTA?抑制核酸酶50mmol/L葡萄糖 25mmol/L?Tris．Cl(pH8.0) 10mmol/LEDTA(pH8.0) 溶液（NaOH裂解细胞与核酸变性、SDS裂解细胞与蛋白质变性） 0.2mol/L?NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释） 1%SDS 溶液（乙酸钾置换钠离子、冰乙酸调节pH?值） 5mol/Ｌ乙酸钾?60ml 冰乙酸?11.5ml 水?28.5ml 异丙醇无水乙醇蒸馏水（一）细菌培养和收集 将含有质粒的Ecoli菌种接种在LB固体培养基（含50 μg/ml Amp）中，37oC培养12~24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基（含50μg/ml Amp）中，37 oC振荡培养约12小时至对数生长后期。 （二）质粒DNA的少量快速提取（碱法） 1．取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中，，弃上清，倒置片刻，使液体流尽。2．菌体沉淀重悬于00μl溶液中，剧烈振荡使菌体充分重悬，加入新配制的溶液00μl，盖紧管口，立即将离心管缓慢颠倒数次直到溶液变清亮。 3．加入μl预冷的溶液，盖紧管口，缓缓颠倒离心管数次直到白色沉淀充分形成，冰浴5min，离心5分钟4．上清液移入干净eppendorf管中，加等体积的氯仿/异戊醇（24:1），混匀，放置片刻。离心5分钟。 5．将水相移入干净eppendorf管中，加入异丙醇，震荡混匀后，离心5分钟。 6．弃上清液，将管口敞开倒置于卫生纸上，使所有液体流出，加入1ml 70%乙醇液沉淀一次，离心5分钟。 7．吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。 8．将沉淀溶于μl TE缓冲液（pH8.0，含20μg/ml RNaseA）中，储于-20冰箱中。 【注意】 提取过程尽量保持低温。 采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好。 沉淀DNA通常用冰乙醇，低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。 质粒沉淀离心后,在管底能见到少量白色物质。真空干燥后，无色，贴于管壁。加ddH2O或TE能迅速溶解。质粒中含太多杂质，则干燥后会呈白色或褐色，不易溶解。质粒用酚、氯仿法从工程菌中提取的质粒一般有三种构像，即超螺旋，线形和开环。（开环质粒是指双链环状的质粒DNA有部分解链，因此电泳速度最慢）三种构像的质粒在琼脂糖电泳的前后顺序是超螺旋线形开环，线形的质粒在中间，而开环的质粒在最后。DNA特异性扩增技术。模拟体内DNA复制过程，通过变性、退火、延伸三步反应的循环完成，靶基因的双链DNA变性为单链，特异的引物在退火过程中与单链DNA模板聚合，在靶DNA的指导下引物的3’末端延伸靶DNA的互补链，完成一个循环。理论上，每一循环使DNA分子扩增一倍，n次循环后，DNA分子扩增为2n； 高温变性：94℃，目的基因变性为单链，以作为扩增的模板； 低温复性：55～60℃，一对特异性引物分别与模板3’端互补结合； 适温延伸：72℃，延伸反应； 本实验PUC19质粒多克隆位点两侧含有恒定序列，用此序列为特异性引物进行PCR扩增，产物长度为158bp，以此鉴定PUC19质粒。 三、实验用品： 四、实验步骤： 1、50ul反应体系的配制，如表： ddH2O 32.6ul 10*buffer 5ul MgCl2(25mM) 5ul dNTP(10mM) 1ul P1(10uM) 1ul P2(10uM) 1ul Taq酶(5U/ul) 0.4ul DNA模板 4ul 充分混合，放入PCR仪扩增 反应条件： 94.0℃