大肠杆菌R基因克隆载体的构建与鉴定.docVIP

大肠杆菌R基因克隆载体的构建与鉴定 [摘 要]DNA的重组与转化是分子生物学的基本实验操作。本实验可分为质粒DNA提取与鉴定，目的片段扩增与鉴定，DNA重组与转化三部分。本次实验可以全面提高学生的实验技能与逻辑思维，对于分子实验技能的培养具有重要意义。 [关键词]DNA重组；转化；分子实验基本操作 大肠埃希氏菌是常用的实验菌种，其质粒R-pGEX-4T-1为人工设计，已加入R目的基因片段。现需要将R基因转到pMD18-T Simple Vector载体质粒上，并将目标质粒转化入大肠杆菌感受态细胞，并检验转化效率。 1
材料与方法 1.1 材 料 1.1.1
菌株及质粒 E. coli DH5α；R-pGEX-4T-1质粒；pMD 18-T载体。 1.1.2 主要试剂和仪器 溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，TE缓冲液，0.5M EDTA，5*TBE，氯仿:异戊醇（V:V，24:1），70%乙醇，50mg/mL Carb，10*loading-buffer，2.5mmol/L dNTP混合物，Taq酶，DNA模板，引物对，10*PCR buffer，50*TAE，0.1M CaCl2溶液，LB固体/液体培养基，5 mg/ml Tet，34 mg/ml Cam，3 M NaAC，10 mg/mL X - gal，200 mg/mL IPTG（以上常规试剂全部按照《分子生物学实验指导》要求配制）；恒温摇床，台式离心机，高压灭菌锅，凝胶成像仪，琼脂糖凝胶电泳系统，PCR热循环仪，低温离心机，超净工作台。 1.2 方 法 1.2.1 质粒DNA提取 向含Carb（100μg/mL）的LB液体培养基中接入含R-pGEX-4T-1质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。质粒DNA用碱裂解法制备，具体步骤参照《分子生物学实验指南》。用1％琼脂糖凝胶电泳验证质粒提取结果。 1.2.2 质粒DNA双酶切及鉴定 运用XhoⅠ酶与EcoRⅠ酶对上述步骤中提取的质粒R-pGEX-4T-1进行双酶切，酶切反应体系参见表1（如下），37℃反应1.5小时。并用1％琼脂糖凝胶电泳验证酶切结果。 1.2.3 目的DNA片段的扩增与纯化 根据质粒R-pGEX-4T-1的序列，设计一对R基因引物（表2）用于R基因的扩增。PCR反应体系以质粒DNA为模板，用25μL反应体系进行扩增（表3），反应条件：94 ℃预变性5min，94 ℃变性40sec，55 ℃退火50sec，72 ℃延伸50sec，重复30个循环，72 ℃延伸8min。PCR产物经琼脂凝胶电泳图像分析鉴定,并按照胶回收试剂盒步骤，割胶纯化，回收 PCR产物，-20℃低温保存。 表1 酶切反应体系 表3 PCR反应体系 表2 扩增R基因所用引物 1.2.4 DNA重组与转化 用CaCl2处理大肠杆菌，制备感受态细胞，具体步骤参照《分子生物学实验指南》。按照表4构建连接重组体系，16℃连接反应30min，制备重组质粒。将5μL连接产物加入至200μL DH5α感受态细胞中，冰中放置30min；热激，恢复性培养后去上清涂布于含有X-gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基，倒置平皿37℃培养过夜（12～16h），形成单菌落，计数白色、蓝色菌落。 表4 质粒连接重组体系 pMD18-T Simple Vector（50ng/μL） 0.5μL Insert DNA（0.1pmol～0.3pmol） 3μL ddH2O up to 5μL Ligation Mix 5μL 总体积 10μL 2 结果 2.1 质粒DNA提取结果鉴定 2.1.1 质粒提取后，1％琼脂糖凝胶电泳。（实验结果图缺失） 2.1.2 质粒双酶切二次鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳（如图一）显示出特异性条带说明质粒中确含有R基因，质粒提取成功。 M：DL2000 maker；1：双酶切结果产物 M：DL2000 maker；1：R基因PCR产物 图一 质粒R-pGEX-4T-1双酶切鉴定结果 图2 R基因PCR鉴定结果 2.2 目的DNA片段的扩增鉴定 用所设计的引物对目的片段R基因进行克隆，得到R基因（600bp）（如图二）条带清晰、亮度高，证明PCR结果较为理想。 2.3 DNA转化结果鉴定 本部分实验结果不成功，培养基表面涂花，无单菌落长出。 3 讨论 细菌质粒的获取，与DNA重组与转化，是分子生物学的基本实验操