从母血细胞和血浆提取胎儿DNA效率的比较研究.doc

　  2006年 1月  武汉大学学报 (医学版) Medical Jo urnal of Wuhan University  Vol. 27 No . 1 J an , 2006  从母血细胞和血浆提取胎儿 D NA效率的比较研究 王　燕　张元珍　王　萍 武汉大学中南医院妇产科　武汉　430071 摘要　目的 :通过比较全血和血浆中提取的胎儿 DNA对诊断结果的影响 ,寻找最适的非创伤性产前诊断的方 孕育女性胎儿孕妇 ,没有 1例出现假阳性结果。结论 :血浆游离 DNA直接分析法的检出率相对高于外周血细胞 DNA模板制备法 ,血浆中游离 DNA是极为适合的材料来源。 关键词　产前诊断 ;聚合酶链反应 ;胎儿 DNA Study of Comparing Eff iciency of Fetal D NA Extracting from Maternal Cells and Plasma WANG Yan , ZHANG Yuanzhen , WANG Ping Dept. of Obstet rics Gy necolog y , Zhongnan Hos pital of W uhan Universit y , W uhan 430071 , Chi na Abstract and bloo d cell s f ro m 23 wo men carrying male fet uses was 96 % and 65 % respectively ( P 0. 05) . Key Words　Prenatal Diagno sis ; Polymerase Chain Reactio n ; Fetal DNA 　　自从 Lo等学者首次发现孕妇血中存在胎儿 DNA以来 ,已为众多的科学家所证实 [ 1 ,2 ]。但由于 母体外周血循环中的 DNA的数量相对较少 [ 3 ] ,使得 从何种途径抽提 DNA成为十分重要的一个问题。 5月在我院就诊的孕单活胎孕妇 ,共 28例。孕妇年 本文以相同研究对象的不同取材途径的比较分析来 ( ) 课题来源 :湖北省教育厅资助项目 (2000B03030) 产 92  武汉大学学报 (医学版)  第 27卷  并症 ;无先兆流产 ,妊娠期高血压疾病等妊娠并发 症。14例孕妇为首次妊娠 ,其余 14例为第 2次或第 3次妊娠 ,但孕妇前次妊娠与本次妊娠间隔至少半 年。此外 ,采 1例未婚且无妊娠史的健康女性及 1 例健康男性外周血各 5 ml ,置于 ED TA管中备用 , 分别作为阴性和阳性对照。 1 . 2　方法 1 . 2 . 1　主要试剂　T aq DNA聚合酶 ,dN TP ,10× 靶序列的体外扩增引物。 引物的合成 :引物按文献[6 ]设计合成 ,序列如下 : 1 . 2 . 2　DNA的制备 1 . 2 . 2 . 1　从血浆中提取游离的 DNA。取外周血 2 ml ,经 ED TA抗凝之后 ,以 3 000×离心 10 min ,小 心转移上清 ,重复离心 1次。将血浆置 - 20备 用。每例血浆装于 1个 0. 5 ml的离心管中 ,加热至 99,5 min。12 000×室温离心 ,10 min。取上清 液作为巢式聚合酶链反应模版。 1 . 2 . 2 . 2　从全血中提取 DNA。取外周血 2 ml ,经 ED TA抗凝之后 ,每 300μl置于 1. 5 ml EP管内 ,用 美国苏普津公司的全血 DNA快速分离试剂盒 ( Whole Blood DNA Isolatio n Kit )提取 DNA。阴、 阳性对照样品也用试剂盒提取 DNA。 扩增系统反应体积为 100μl ,血浆模板 10μl ,含 10 ×PCR Buffer ; 3 mmol/ L MgCl 2 ; dA TP , d T TP , d GTP ,dC TP各 200μmol/ L ;正向引物和反向引物 各 50 p mol/ L ,1 U的 T aq酶。用引物 Y1. 1 , Y1. 2 为 :94,5 min后 ,94,60 s ,60℃,60 s ,72℃,60 s ,30次循环 ;然后 ,72,10 min。 在 1 %琼脂糖凝胶电泳中点样电泳检测。此次 PCR 产物预期大小为 149 bp。 1 . 2 . 5　统计学处理　计数资料组与组之间率的比 2 2　结果 　　28名孕妇中 ,有 23例孕育男胎 ,5例孕育女胎。 23例孕育男性胎儿的孕妇中 ,取材于外周血 ,出现 假阴性 8例 ;而取材于血浆游离 DNA ,出现假阴性 1 例 (表 1)。5例妊娠女胎的孕妇中无 1例假阳性的  结果 (图 1、)。上述两种取材途径的总检出率分别 为