地高辛标记探针的Southern-杂交.docVIP

地高辛标记探针的Southern 杂交 （DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit I ，Cat.No.11 745 832 910，Roche Diagnostics GmbH，Germany） 1. 探针标记步骤（20μl 体系）： 将10ng-1μg模板DNA用无菌去离子水补足至16μl。 沸水浴或干浴锅98 ℃ 10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。 充分混匀DIG-high Primer （1#管），并取4 μl至变性DNA管，混匀并离心。 37 ℃温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）。 停止反应，加2 μl 0.2M EDTA（pH 8.0）或65 ℃加热10分钟。 2. 探针标记效率检测： 将地高辛标记好的探针作一系列的稀释，点到一条尼龙膜上，同时用地高辛标记的control DNA作对照标准，120℃固定30分钟；然后用地高辛抗体免疫检测，按BNT/BCIP显色步骤显色；比较显色结果，选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。操作步骤如下： 根据表1 DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针的标记产量将标记的探针稀释到1ng/μl，将试剂盒提供的control DNA稀释到1ng/μl 原始浓度是5ng /μl ，然后按照表2作一系列的稀释探针及control DNA 表1 DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针标记产量 Template DNA 1 h 20 h 10 ng 45 ng 600 ng 30 ng 130 ng 1050 ng 100 ng 270 ng 1500 ng 300 ng 450 ng 2000 ng 1000 ng 850 ng 2300 ng 3000 ng 1350 ng 2650 ng 表2 探针DNA及Control DNA 系列表 Tube DNA μl From Tube # DNA dilution buffer μl Dilution Final concentration 1 ? Diluted orginal 1ng/μl 2 2 1 198 1:100 10 pg/μl 3 15 2 35 1:3.3 3 pg/μl 4 5 2 45 1:10 1 pg/μl 5 5 3 45 1:10 0.3 pg/μl 6 5 4 45 1:10 0.1 pg/μl 7 5 5 45 1:10 0.03 pg/μl 8 5 6 45 1:10 0.01 pg/μl 9 0 - 50 - 0 将上述稀释的2-9 号管的control DNA 及探针DNA各取1μl点膜 120℃固定30分钟或紫外交链3-5分钟 将膜放入装有20ml Maleic acid buffer 的塑料器皿中，室温振荡2分钟 将膜放入10ml Blocking solution中室温温育30分钟 将膜放入10ml Antibody solution 中室温温育30分钟 用10ml Washing buffer 洗2次，每次15分钟 在10ml Detection buffer 平衡2-5分钟 将膜放入2ml 新配制的Color substrate solution 中暗室条件下显色。显色过程中不要摇动或振荡 当斑点或带显示出来后，用50ml灭菌的双蒸水洗膜5分钟，照相 染色至0.1pg的Control DNA出现斑点，比较标记的探针与Control DNA 染色情况计算出地高辛标记的DNA 的量：如果0.1pg的探针及对照稀释点都显色，则探针标记理想；如果0.1pg的对照显色， 0.1pg的标记探针没显色，但0.3pg显色，则计算探针浓度（约为理想浓度的1/3）以确定杂交时加多少探针（25ng探针/ml杂交液）；如果0.1pg的对照显色，但标记探针0.3pg的斑点没显色，则应重新标记探针。 （转膜被省略。） 去嘌呤缓冲液：place the gel in a plastic tray.cover with 250 mM HCl. agitate gently until the bromophenol blue dye turns yellow 5 minutes . agitate a further 15 minutes and rinse with distilled water. 碱变性液：1.5 mol/L NaCl, 0.5 mol/L NaOH 中和液：0.5 mol/L Tris-HCL pH 8.0 ,1.5 mol/L NaCl 20×SSC：2 mol/L NaCl, 0.3 mol/L