人IGF-Ⅰ基因慢病毒介导RNA干扰有效靶点的设计及筛选.pdfVIP

人IGF-I基因慢病毒介导RNA干扰有效靶点的设计及筛选 刘红升 赵晓东 苏琴 袁晓玲 党伟 果应菲 姚咏明 首都地区军队急救中心 解放军总医院第一附属医院急诊科北京 北京海淀区阜成路51号 100048 ［摘要］目的：设计并筛选人IGF-I有效RNA干扰片段，构建IGF-I-siRNA慢病毒表达载体。方法：对人 IGF-I基因编码区分析、筛选序列4条，阴性对照序列1条。与pGCL-GFP质粒重组后，转染大肠杆菌感受态 细胞。阳性克隆经过鉴定后得到正确重组子，制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载 体质粒，共转染293T细胞，体外直接感染表达IGF-I的人血管平滑肌细胞。通过用Realtime-PCR检验干扰效 果。 忽略=结果：1、成功地合成四条编码发夹siRNA序列的单链DNA，并将其克隆到pGCSIL-GFP载体中，构建重组 质粒PscS（I）-1、2、3、4，及无关基因的重组质粒PSC-NC，酶切鉴定和测序证实载体构建成功。2、Realtime-PCR 检测IGF-I的mRNA表达，发现重组质粒PscS（I）-1转染人血管平滑肌细胞后IGF-ImRNA表达最低，重组质粒 PSC-NC转染组细胞内IGF—ImRNA的表达量与空白对照的水平接近(P＞0.05)。结论：1．成功构建了小的发夹 式IGF-I慢病毒表达载体。2、在人IGF-I序列位点1010～1028bp、序列为ACCTTGTCTAAGTGGTTTA可以在人血 管平滑肌细胞中实现对人IGF-I基因表达的有效沉默。 ［关键词］类胰岛素生长因子-I；慢病毒表达载体；RNA干扰 DesignandScreeningofclipsiRNAientiviralvectorofHumanIGF-I 1LIUHong-sheng1ZHAOXiao-dong1SUQing 1theFirstassociatedhospitalofChinesePLAGeneralhospital,BeijingChina100048 [Abstract]objectives:ToconstructtheclipSiRNAlentiviralvectortoclarifyitsfunctions.Methods:Design4 genesequencesand1non-sencecontrolgenesequenceconsistentwiththescreeningfeaturedescribedinprevious articlesusingopenwebsites,andthesequencesweresynthesizedwiththehelpofGenechemCompany.The sequenceswereamplificatedinBacteriumcoliafterrecombinantedwithpGCL-GFPplasmid.AfterPCRand sequencingidentification,thepositivecloneswerepackagedintovialhost293Tcellsusingliposome-mediated transfection. 忽略=Andcollectsupematanttoinfecthumancoronaryarteryvascularsmoothmusclecells(hCASMCs)in vitro.WedetecttheexpressionofIGF-IusingRealtime-PCR.Results:PCRandDNAsequencingcertificatethatthe oligonucleotideswerecorrect.shRNAlentiviralvectorcanreducesignificantlytheexpressionofIGF-ImRNAand proteinby65％,andeffectivelysilenceIGF-Igeneinculturedcells.Conclusions:Wedesignedandrecombinanted validsiRNAofHumanIGF-I,andpackagedlentivirusvector.TheconstructionoflGF-I-siRNAlaysfoundationfor thestudyofthefunctionofthegene. KeywordsIGF-I； LentiviralExpre