Chk1chk2在Aβ致伤海马神经元中的表达及意义.pdfVIP

· 72 · 黑龙江医药科学 2015年2月第38卷第 1期 Chkl／chk2在 AI3致伤海马神经元中的表达及意义① 黄昕艳 ，尉荣翠 ，杨 智 ，李 壮 ，刘 爽 (1．佳木斯大学附属第二医院神经内科，黑龙江 佳禾斯 154002；2．佳木斯大学遗传教研室，黑龙江 佳木斯 154002；3．佳木斯大学附属第 一 医院肿瘤科 ，黑龙2．r-佳木斯 154003) 摘要：目的：探讨Chkl／chk2在AB致伤海马神经元中的表达及意义。方法：应用新生(3d以内)SD大鼠采用急性分离、胰 酶消化的方法培养海马神经细胞 ，分别于AB25—35致伤0h、8h、16h、24h，并采用免疫细胞染色观察各时间点Chkl／chk2表达 情况。结果：体外培养的神经细胞生长状态良好，免疫细胞染色鉴定结果表明Chkl、chk2蛋白在A0致伤神经元后，随致伤时 间延长均有表达，且以chkl表达显著，在致伤 16h有差异明显 (P0．05)。结论：Chkl／chk2共同参与了在Ap致伤海马神经 元中的DNA损伤修复，以chkl表达更显著，提示可望为AD中神经元的DNA损伤修复提供新的干预点。 关键词 ：海马神经元；Chkl／chk2；A口 中图分类号：R741．02 文献标志码：A 文章编号 ：1008—0104(2015)01—0072—02 近年来的研究指出，细胞周期的异常可能是 的6孔培养板 内，置于 37℃，5％CO：培养箱 中培 AD发生的较早期事件 ，这种异常的细胞周期可导 养 。24h后换含 2％B27的DMEM／F12培养基，每 致细胞的凋亡，最终引发 AD。成熟神经元再进入 隔3d半量换液 1次。 细胞周期与DNA损伤有关，在DNA损伤修复过程 1．2．2 原代神经元鉴定 一] 中不可回避的涉及到细胞周期检测点激酶Chkl和 NSE免疫细胞化学鉴定：培养至第 7d的神经细 (或)Chk2的活化 ，而 Chkl和(或)Chk2在AB致 胞，以PBS轻洗 3遍 ，4％多聚 甲醛固定 30min后， 伤神经元中的激活情况尚未见报道，故本研究以AB PBS洗 2次。0．4％TritonX一100破膜 20min，PBS 致伤神经元为 AD的细胞模型，探讨 Chkl和 Chk2 洗3遍 ，山羊封闭血清封闭30min，滴加NSE(1：200 在AB致伤神经元的表达差异，为 AD中神经元的 稀释)一抗，4~C湿盒内孵育过夜。次 日加二抗室温 DNA损伤修复提供全新的干预点。 避光孵育50min，加新鲜配制的DAB溶液显色，光 1 材料与方法 镜观察。 1．1 材料 1．2．3 A[325—35致伤及实验分组 新生SD大鼠(1～3d)，由佳木斯大学实验动物 海马神经元培养 7d后，弃原培养液，加入 中心提 供 (动 物质 量 合格 证 号：黑动 字 第 DMEM培养液及终浓度为 101xmol／L的A[325—35 。药物及试剂 DMEM／F12干粉培养基、 (前期实验筛选的最佳致伤浓度)孵育，A1325—35 B27、胎牛血清均购 自美 国Sigma公司，A1325—35购 肽分别孵育 0h、8h、16h、24h终止培养，分别 以 自北京博奥森生物技术有限公司，兔抗大鼠单克隆 chkl、chk2为一抗，进行免疫细胞化学染色。每组 6 神经元特异性烯醇化酶 (neuronspecificenolase， 孔，每张盖玻片上随机选取6个视野，高倍镜下综合 NSE)单克隆抗体、SABC即用型试剂盒、DAB显色 染色强度和阳性细胞所 占比例进行半定量测定。染 试剂盒购于 Boster公司。 色强度评分标准：不着色 0分；黄色 1分；棕黄色 2 1．2 方法