第4章 常用技术和培养方法.pptVIP

* 第四章 常用技术和培养方法 常用技术和培养方法 4.1组织培养实验的一般步骤 4.2 组织培养的灭菌技术 4.3 常用培养方法 4.4 组织培养实验观察方法、数据调查与分析 一般步骤： 培养目的的选择 3. 外植体的选择 4. 接种与继代操作 5. 试管苗驯化 4.1组织培养实验的一般步骤 一般步骤： 培养目的、文献检索、外植体、培养方法和条件、继代、试管苗驯化 4.1组织培养实验的一般步骤 2. 培养目的的选择： 快繁、种质保存、次生代谢物质、产生单倍体、三倍体、遗传变异、生理研究、转基因研究。 4.1组织培养实验的一般步骤 3. 外植体的选择： 重要性：外植体是植物组织培养的内因，在很大程度上影响了组织培养的成败。外植体的类型（组织、器官种类）主要取决于培养的目，但外植体的培养效果还受许多因素的影响。 4.1组织培养实验的一般步骤 影响外植体培养效果的因素： 基因型（物种、品种） 生理与健康状态（植株的年龄、组织或器官的年龄、生长环境、部位）、 体积、 损伤等。 4.1组织培养实验的一般步骤 可以采用一些措施改变植株的生理状态: 如喷激素、 施肥、 短日处理等 最常用的外植体： 一般快速繁殖用芽作外植体； 愈伤组织诱导双子叶植物用子叶、下胚轴，单子叶用盾片等； 4.1组织培养实验的一般步骤 4. 接种与继代操作： 接种：无菌操作、减少损伤、均匀整齐、注意方向。定期观察、记载。 继代的作用：增殖、更新营养、防止有害代谢物积累、改变培养基成分（如愈伤转分化、芽转生根等）等； 继代的时间：随目的方法不同而不同。 4.1组织培养实验的一般步骤 5. 试管苗驯化p54： 需要：自养——异养，高湿——低湿，无菌——有菌，恒温——变温，低光——高光 措施：壮苗培养；开口锻炼；选择介质；逐步过渡。 4.1组织培养实验的一般步骤 常用技术和培养方法 4.1组织培养实验的一般步骤 4.2 组织培养的灭菌技术 4.3 常用培养方法 4.4 组织培养实验观察方法、数据调查与分析 1. 基本灭菌方法： 2. 器械灭菌 3. 外植体灭菌 4. 培养基灭菌 5. 注意问题 4.2 组织培养的灭菌技术 1. 基本灭菌方法： 辐射灭菌：紫外线，用于空气和表面灭菌。 火焰灭菌：用酒精灯、煤气灯火焰烧，适用于接种工具灭菌。快速简单。 干热灭菌：用烘箱，160℃，2hr。适用于玻璃器皿和器械。方法：铝箔包裹、自然冷却。 湿热灭菌：见灭菌锅使用；最常用，培养基、水、玻璃器皿、各种器械。 过滤灭菌：热不稳定的物质需要过滤灭菌。装置： 化学灭菌：操作表面用70％乙醇灭菌；外植体的表面灭菌通常用70%乙醇、NaOCl、Ca(OCl)2 0.1% HgCl等。 抗生素使用：植物组培中少用。 4.2 组织培养的灭菌技术 2. 器械灭菌： 将器械洗干净，浸泡再80%的乙醇中，用酒精灯火焰短暂灼烧。 4.2 组织培养的灭菌技术 3. 外植体灭菌： 消毒剂； 消毒程序： 技巧：直接消毒、间接消毒。 4.2 组织培养的灭菌技术 4. 培养基灭菌： 一般用湿热灭菌，不耐高温的物质应单独过滤灭菌后，在培养基冷却之前加入，液体培养基有时也用过滤灭菌。 4.2 组织培养的灭菌技术 5. 注意问题： GA3、维生素、蔗糖的降解问题； 灼烧问题； 紫外灯的危害； 消毒剂对皮肤的损害。 4.2 组织培养的灭菌技术 常用技术和培养方法 4.1组织培养实验的一般步骤 4.2 组织培养的灭菌技术 4.3 常用培养方法 4.4 组织培养实验观察方法、数据调查与分析 1.固体培养： 2.液体培养（悬浮培养）： 类型：分批培养（batch culture）、连续培养（continuous culture） 3.单细胞培养： 4.其他方法：双层培养、隔滤纸培养等 4.3 常用培养方法 1.固体培养：用琼脂或植物胶等凝胶使培养基固化成固体培养基进行的培养。优点：操作简单、通气好、外植体固定；利于愈伤组织的诱导、和分化，应用最广。 4.3 常用培养方法 2.液体培养悬浮培养）：液体培养基的悬浮培养一般用于愈伤组织的繁殖、分散，主要用于分离单细胞、产生体细胞无性系、生产次生代谢物质等。需要摇床设备，频繁继代。 类型：分批培养（batch culture）、连续培养（continuous culture） 4.3 常用培养方法 3.单细胞培养： 平板培养（plating method） 看护培养（nurse culture，） 微室培养（microchamber culture，） 纸桥培养（paper wick method，） 4.3 常用培养方法 4.其他方法：双层培养、隔滤纸培养等 4.3 常用培养方法 *