过氧化物酶活性测定-滴定.pdfVIP

实 验 八 过氧化物酶活性的测定 一、实验目的： 学习和掌握过氧化物酶(POD)活性测定的原 理及方法。 二、实验原理: 过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。 它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植 物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中 活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使 组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程 度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加， 所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过 氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视。 过氧化物酶能催化过氧化氢氧化酚类，产物为醌类化合物， 此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化 合物。本实验是以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物 酶的底物，在该酶存在下，H O 可将邻甲氧基苯酚氧化成红 2 2 棕色的4-邻甲氧基苯酚，其反应为： 该红棕色的物质在波长470nm处有最大光吸收，故可 通过测470nm处的吸光度变化来测定过氧化物酶的活性。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．材料：三叶草,苦豆子叶片 2 ．仪器： （1）分光光度计； （2）电热恒温水浴锅； （3）离心机； （4）天平 （5）25mL容量瓶； （6）电炉等 3 ．试剂： (1) 0.05M磷酸缓冲液(pH5.5) (2) 0.05M愈创木酚溶液 (3) 2%HO 溶液 2 2 四、操作步骤 1．酶液提取：称取0.5g大麦苗于研钵中→加入 2ml磷酸缓冲溶液→研成匀浆→转入离心管中 →再加3ml磷酸缓冲溶液冲洗研钵→转入离心 管中→等重→ 8000r/min离心10min →取上清 液转入25ml容量瓶→沉淀用5ml磷酸缓冲溶液 再提一次→上清液并入25ml容量瓶定容。 2、过氧化物酶活性测定： 0.05M 2% 0.05M 酶 沸 冷 磷酸 H O 愈创木 液 沸 编 缓冲 2 2 酚溶液 (ml) 37℃ 水 却 液 (ml) 水 OD470nm 号 (ml) (ml) 浴 水浴 浴 5 CK 2.9 1.0 1.0 0.1 调零 min 10 测 min 6 定 2.9 1.0 1.0 0.1 ？ 管 min 五、结果计算 以每分钟光密度（OD470nm ）变化0.01为1个过氧化 物酶活力单位，即： △OD 470nm 过氧