5L发酵罐发酵L-乳酸（综合性试验）.doc

5L发酵罐发酵L-乳酸（综合性试验） 实验指导书 5L发酵罐发酵L-乳酸实验涉及微生物学，生物工程原理，有机酸工艺学，发酵工厂设备，工业发酵分析等多门课程内容。希望同学们复习这些相关知识，了解从生产菌种到发酵法制备大宗化工原料的全过程。 实验目的 学习掌握利用发酵法生产L-乳酸的原理和工艺操作。 熟练掌握5L发酵罐的结构和使用方法。 掌握L-乳酸、残糖和菌体浓度的测定方法。 实验原理 乳酸分子式为：CH3CH2OCOOH，分子量90.08，因为乳酸分子内含有一个不对称的C原子，从而具有D-型和L-型两种构型。L-乳酸为右旋，D-乳酸是左旋的，当L(+)-乳酸和D（-）-乳酸等比例混合时，即成为消旋的DL-乳酸。 乳酸生产有三种方法：化学合成法，酶法和微生物发酵法。发酵法制备乳酸是以淀粉、葡萄糖、等糖类或牛乳为原料，接种微生物经发酵而生成乳酸。乳酸发酵机理主要有:Ⅰ.同型乳酸发酵，Ⅱ.异型乳酸发酵，Ⅲ.双歧杆菌发酵。 本实验用菌为嗜热乳酸杆菌(T-1)，发酵方式为同型乳酸发酵。发酵机理如下： 葡萄糖经 EMP 途径降解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下还原为乳酸。发酵方式如下： 经过这种途径， 1 mol 葡萄糖可以生成 2 mol 乳酸，理论转化率为 100 ％。但由于发酵过程中微生物有其他生理活动存在，实际转化率不可能达到 100 ％。一般认为转化率在 80 ％以上者，即认为是同型乳酸发酵。工业上较好的转化率可达 96 ％。 三、实验用品 实验器材 全自动式5L发酵罐 上海理工大学高机实业总公司） 手提式压力蒸汽灭菌锅 北京市将台医疗设备厂镇海联营厂 752紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司 MY－879型生化培养箱 天津轻工业学院 DGG型电热鼓风干燥机 天津天宇机电有限公司 YP1200型电子天平 上海精密科学仪器有限公司 GH801型超净工作台 天津净化仪器厂 TGL－16G台式高速离心机 上海医用分析仪器厂 SBA－40C型生物分析传感器 山东省科学院生物研究所 HZQ－Q恒温振荡器 东联电子技术开发有限公司 蒸汽发生器DZF-3 上海航星机械有限公司 其他：量桶、烧杯、离心管、移液管、酒精等、接种环、PH试纸 玻璃棒等 2、试剂 （1）种子培养基（g/L）：葡萄糖（玉米糖化液）30、酵母膏5、 蛋白胨5、CaCO3 10 （2）发酵培养基（g/L）：葡萄糖（玉米糖化液）100，酵母膏5、 蛋白胨5、豆浓3 （3）8mol/lNaOH溶液 消泡剂 四、实验程序 （1）分析方法 1．葡萄糖和L-乳酸的测定 发酵液中葡萄糖和乳酸的测定采用SBA-40C型生物传感分析仪测定。方法：首先将发酵液离心，吸取上清液，稀释250倍，进样测定。 2．菌体浓度的测定 发酵液经高速离心后，用0.1moL/L盐酸溶液洗涤沉淀除去残余CaCO3，离心两次后，弃上清液，将菌体悬浮于10mL蒸馏水中，用分光光度计测定A值。 （2）操作方法 1．玉米糖化液的制备 把500g玉米粉加入到2000ml水中，每100g玉米加入1mlα-淀粉酶，先加入75%，搅拌均匀，在85～90℃保温1小时，加热煮沸，待温度再降至90℃时，加入另外的25%的α-淀粉酶，降温到50～60℃，加5ml糖化酶保温6～8小时，得到玉米粉水解糖液。 2．种子培养 ①空消：空罐灭菌。 ②实消：将发酵培养基2.7L从进样口倒入5L发酵罐中，盖上盖子。检查发酵罐安装完好后，盖上灭菌罩，105℃灭菌15分钟。 ③校正：校正pH电极、溶氧电极（校正方法参考5L罐使用说明书） ④接种与发酵：在接种圈的火焰保护下，将种子培养液300mL倒入发酵罐中，控制发酵温度50℃，pH为6.0, 溶氧:0～20h通风60L/h，发酵罐搅拌 100r/min，20～72h停止通风和搅拌。以NaOH为中和剂。 ⑤测量：每隔4h取样，测菌体浓度、葡萄糖和L-乳酸浓度。 (3)注意事项： ①使用SBA～40C生物传感分析仪要严格按照使用说明进行，进样针使用完毕后要用蒸馏水清洗，以防进样针堵塞。 ②使用蒸汽发生器灭菌时注意蒸汽发生器压力不要太高，以免发生危险。 五、实验数据处理 发酵培养时，按照一定的时间间隔取样测定并记录，结果如下表。 时刻 时间 ／h 葡萄糖浓度 /(g/L) 菌体浓度A600 L-乳酸浓度 /(g/L) 签名 12：00 0 16：00 4 20：00 8 24：00 12 4：00 16 8：00 20 12：00 24