食管癌与癌旁上皮基因表达谱差异.pdfVIP

108 中国癌症研究进展⑥ 食管癌和癌旁上皮基因表达谱差异 吕桂泉许沈华钱丽娟牟瀚舟程勇朱赤红用星明刘祥辟包文字 我们采用基因芯片技术分析食管癌和癌旁上皮基因表达谱差异及正常食管上皮组织基因 表达谱的差异。探索食管癌早期发生、发展过程中与肿瘤相关的基因群及其功能，有助于从分 子水平全面了解细胞癌变机制，为食管癌的憔床诊断、预防、易感性预测和治疗提供分子标记 和靶基因。 材料与方法 (一)组织材料 9月7日)的食管癌病人标本。手术切除后立即取食管癌和癌旁上皮(距离0．5m)及远端正 常食管上皮冻存于液氮。另一半做病理切片，镜下观察癌旁上皮均未见癌，远端食管上皮均正 常。临床和病理资料：男7例，女4例，年龄42—65，平均年龄56．6岁。高分化鳞癌1例，中分 化鳞癌8例，低分化鳞癌2例。无淋巴结转移，临床Ⅱ期病人6例。有淋巴结转移、临床Ⅲ期病 人5例。 (二)芯片制备 物扩增，PCR反应及产物纯化用标准方法进行，琼脂糖凝胶电泳监控PCR质量。靶基因溶解 于3×SSC点样液中．用Cartesian h水合，室温于燥0．5h，置于紫外交联仪中交联，再分别用 基因重复点2点。点样后玻片经2 0．2％SDS、水及0．2％硼氢化钠溶液处理10min，晾干备用。 (三)探针制备 参照文献”’用一步法分别提取食管癌和癌旁上皮及正常食管上皮总RNA。将液氮中冻存 的食管癌和癌旁上皮及正常食管上皮取出后，立即分别在研钵中边加液氮边捣碎研细至粉末 状，加入D溶液和1％巯基乙醇，匀浆液离心后上清液经1：1的酚一氯仿两次抽提后经NaAc 和酸性5：1酚一氯仿抽提，再经等体积异丙醇沉淀；离心后用Mill—Q水溶解沉淀，紫外分析。 mP,NA 作者单位：31002杭州．浙江省肿瘤医院(吕桂泉许沈华钱丽娟牟瀚舟朱赤红周星明刘祥嶙)； 200092上海，职合基因科技(集团)有限公司(程勇包文字) 食管癌和癌旁上皮基因表达谱差异 109 Ssc+0．2％SDs杂交液中。 (四)杂交及洗涤 将2张芯片和杂交探针分别在95℃水浴中变性5rain．分别将探针加在芯片上，用盖玻片 封片，置于密封舱在杂交箱内印℃杂交15～17 SSC+0．2％SDS，0．1％×SSC溶液洗涤10min，室温晾干。 (五)荧光扫描和结果分析 用md 值，用预先选定的内参照基因(40个管家基因)对Cy3和Cy5的原始获取信号进行均衡和修正。 并对两次重复点进行平均。判断基因差异表达的标准：(1)cy3和Cy5信号的比值的自然对数 PCR结果良好。 结 果 (一)基因芯片杂交信号散点围 用Cy3和cv5的荧光信号值作散点图，其显示出一个很分散的分布图形，大部分聚集在一 个几乎为450的对角线周围的蓝点表示信号差异在0．5—2倍区间，而一些红点分布在45。的对 角线外，有些远离对角线，表示食管癌和癌旁上皮中存在许多表达发生显著改变的基因，它们 与正常对照信号差异大于2倍。 (二)基因表达谱扫描分析结果 癌旁上皮的eDNA探针微点阵杂交的两个点数据取平均值，通过三者的基因表达谱平行比较 所得结果为：食管癌与正常食管上皮比较差异3倍以上共有41个基因，其中表达上调(其荧光 有50个。另外还发现在食管癌中有9个在基因库中没有记录的新基因有待于进一步深入研 究它的功能和命名。癌旁上皮与正常食管上皮比较差异2倍以上共有31个基因，其中表达上 调2倍有27个，表达下调0．5有4个。这些基因按功能分成16大类(见表1)。 110 中国癌症研究进展@ 裹1食管癌、癌旁上皮与正常食管上皮比较差异2和《0．5的基因功能分类 食管癌与正常食管上皮比较差异2倍以上的基因；癌旁上皮与正常食管上皮比较差异2 倍以上的基因；对两者再进行平行比较即获得：13个基因同时出现在食管癌与癌旁上皮中它 讨 论 癌的发生是一系列分子变化的结果，是许多肿瘤相关基因表达失常或许多肿瘤抑制基因