下调Pygo2表达能抑制脑胶质瘤U251细胞增殖.pdfVIP

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2017-08-10 发布于安徽
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下调Py902表达能抑制脑胶质瘤U251细胞的增殖陈玉英2，王海东4，王占祥1 9谭国伟1，刘希尧‘，沈上杭1，薛伟明‘，陈东汉’，陈寿仁‘，张涛。 1厦门大学附属第一医院神经外科 2重庆邮电大学生物信息学院胶质瘤(gl 们前期研究发现脑胶质瘤组织中py902高表达，并随肿瘤恶性程度增加而表达增高。故我们构建了RNA干扰载体，抑制py902在胶质瘤细胞中的表达，以明确其在脑胶质瘤恶性特性中的作用。 l材料和方法 1．1材料 1．1．1细胞株、质粒及菌株脑胶质瘤细咆系U251购于上海细胞研究所，Escherichia basicl扫厦门人学生科院李博安教授惠赠。 J．j人学生命科学院冻存)，质粒pSuper 1．1．2主要试剂和仪器限制性内切酶EcoR Ladder、脂质体转染试剂l I由TaKaRa公司生产。2000bpDNA Syber-green Cruz公司)，羊抗鼠I西二抗和增强化学发盒、胶同收试剂盒购白Qiagen公司，Py902多克隆抗体(美国Santa 光底物(ECL)购白武汉博十德公司。优质胎牛血清购自Hyclone公司，TRizol Dickinson 荧光定簧PCR仪(Bio-Rad公司，美国)，流式细胞仪FACScan(BectonCompany，USA)。 1．2方法 I Ambion公司siRNA在线设计软件，设计了一对带有隆lI、Hindm酶达质粒pSuper的酶切能点的要求，利Hj 通讯作者：l：占祥，E-mail：wangzx@xmbrain．corn 100504) 重庆市教委科技项日(10 313 shRNA：止向序列：切枯性末端终．I卜识别序列和9bpLoop环的短发夹RNA干扰片段。设计序列如下：Py902 反向序列： 5’一AGC shRNA：止向序列：反向序列：进行同源分析，排除1}：特异性抑制其他基冈片断的可能。序列由上海生．I：生物公司合成。 1．2．2载体的构建将合成的寡核苛酸退火形成舣链：真核表达载体pSuper经HindIII和隗lII在37℃顺序酶切、纯化，将上述载体和舣链寡核营酸用T4DNA连接酶连接后。转化人肠埃希DH5Q感受态细胞，铺极、挑 I 克隆。重组克隆提取质粒刖HindI !I：生物公司进行DNA序列测定。 ug in 质粒／2．41jl脂质体转染细胞，具体操作按照Limpofect2000转染试剂盒说明进行。培养48h用丁．后续实验，细胞即分成了二种(组)：control组、scr shl烈A组。 shRNA组、Py902 1-2．4Real—time PCR转染后48d,时收获细胞。