几种适合蚜虫基因组DNA提取方法比较研究.pdfVIP

658 植物保护科技创新与发展 几种适合蚜虫基因组DNA提取方法的比较研究‘ 张烨1’2李克斌2” 尹姣2 曹雅忠2 牛长缨1 (1华中农业大学植物科技学院，武汉430070； 2中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100193) 摘要：蚜虫分子生物学研究的深入对蚜虫基因组DNA的提取工作提出了更高的要求。 本文介绍了3种适合蚜虫基因组DNA的提取方法，并通过电泳检测、浓度和纯度的测定比较 各种方法的利弊。同时，选用TENS法提取不同处理样本的基因组DNA，并获得了理想的 结果。 关键词i蚜虫；基因组DNA；提取方法 分子生物学技术的不断完善和发展为昆虫学领域内的各项研究提供了强有力的手段， 科研学者们认识和研究昆虫也从宏观领域转向核酸水平。而昆虫基因组DNA的提取作为 这类研究的基础工作，就显得尤为重要…。为了满足下游实验的需要，除了要保证DNA 的浓度和纯度合乎要求，还需要提取方法简便易行、容易掌握、成本低廉H-。 蚜虫作为一种典型的小型昆虫，其基因组DNA的提取也相对困难。蚜虫体型微小， 体表有几丁质外骨骼，这就要求研磨破碎虫体必须充分。另外，蚜虫虫体柔软，身体结构 比较脆弱，对于采集，保存也要求严格。近些年，针对蚜虫基因组DNA的提取方法也在 不断完善和改进，以下介绍了3种提取方法，并对各种方法做了比较。 1材料和方法 1．1 实验材料 供试材料为麦长管蚜，包括近两年的采集样本，新鲜或乙醇浸泡标本，分别于一20。C 和一70℃保存。 1．2实验方法 1．2．1试剂盒提取法 稍作修改。 用封口的枪头将液氮处理过的单头蚜虫研磨成粉末状，迅速加入200斗1核裂解液， 取出混合液使其冷却至室温。加150I-LI蛋白质沉淀液，涡旋混匀20S左右，冰上放置 5min。13 000r／min 000r／min离心5rain，取上清液加入600斗1常温异丙醇，颠倒混匀。13 ·作者简介：张烨(1983一)，男．在读硕士生 ¨通讯作者：李克斌．E—mail：likebin54@163．eom 研究论文 离心5min，弃上清，加入600ul75％乙醇颠倒混匀，13 干沉淀。待沉淀完全干燥后，加人适量DNA再水化液，65℃水浴lh(或4℃孵育过夜)。 1．2．2SDS提取法 参照杨子祥等的方法阳’4]，提取步骤略作修改。将单个蚜虫转移到1．5ml离心管中， 加入液氮对其进行处理，并用封口的枪头对其进行简单破碎，迅速加入600ul匀浆液(按 0．05 A液：B液：C液=8：1：1配制。其中A液：Tris·Basemol／L，NaCl0．1mol／L， EDTA 3h，加入6001xl的秭s饱和酚，混匀，7 氯仿：异戊醇(24：1)，混匀，8000r／min离心10rain，取上清液。加入1000i,d预冷无 000 水乙醇，一20℃冰箱内放置30rain以上，12r／min离心lOmin，倾去上清液。加入 500txl冷的70％乙醇，12 溶解。 1．2．3TENS提取法 扰。将单头蚜虫经液氮处理后研磨成粉末状，并迅速加入3001xlTENS缓冲液(TENS： 50mol／L 7．5，400mol／LNaCI，20mol／L Tris-HCI，pH 5mol／L 3～18h。加入85斗1NaCI，旋涡混匀15s，14 体积的冰冷无水乙醇，轻混匀。14 沉淀，加入适量的1’E将提取的DNA重新溶解。 1．3 DNA浓度和纯度检测 结果。 2结果与分析 2．1 不同方法提取基因组的检测结果 2．1．1试剂盒提取法 凝胶背景对比度不强，主带不明显，主带前会有短距离的拖尾。核酸蛋白质分析仪检测结 等杂质。DNA浓度差异不太明显，但全部低于100rig／“l。 2．1．2SDS提取法 随机选取的6个样本均获得DNA(图2)。电泳检测条带基本呈线性，偶有拖尾，但 并不明显，