仿生髓核组织工程支架材料对体外培养髓核细胞生长增殖的影响.pdfVIP

第■屑脊柱外科学术沦坛 脊柱脊髓摹础 文章编号：149 仿生髓核组织工程支架材料对体外培养髓核细胞生长增殖的影响 李长青，周跃，罗剐，张传志 第三军医大学新桥医院骨科 下腰痛是现代社会中一种常见病和多发病，作为仅次于上呼吸道感染的疾病，是导致劳动力丧失 的主要原冈之一。腰椎问盘突出症等椎问盘退行性变是引起下腰痛最常见的原冈。研究开发符合椎问 盘和威髓核结构与功能的移植物．对退变椎问盘进行功能重建．已成为治疗退行性椎问盘疾病比较理 想的解决方案。近年来组织工程学技术的迅速发展，为体外构建理想的椎问盘组织创造了极其有利的 条件并提供了可能。采用组织工程学技术构建椎问盘的研究目前围外尚处于起步阶段．国内未见报道。 目前文献报道中应用于组织工程化髓核的细胞支架基本来源于骨或软骨组织工程的生物材料。文献中 尚未报道髓核组织工程设计构建的专用支架材料。冈此探索构建理想的细胞支架。成为髓核组织工程 研究的重点和难点之一。为此，我们设计和构建了仿生髓核组织工程支架材料--CHCS支架，并对其 理化性能、免疫原性进行了研究，表明该支架材料就前述两方面而言具有良好的性能，可进行深入的 研究。本实验在此基础上，观测了CHCS支架材料对体外培养髓核细胞生长增殖的影响。 一、材料与方法 W龄乳兔(第i军医大学实验动物中心提供)．用0．5％戊 (一)髓核细胞的体外分离、培养3 巴比妥钠0．1 mg／kg体重肌注处死。常规消毒铺巾，无菌条件下将朐腰段脊柱整段取出，尽量剥尽椎问 盘前缘所附着的肌肉，用D—Hank’s液(含终浓度100万u／l的青霉素和终浓度为lg／l的链霉素)冲洗2 遍。剪开椎问盘纤维环，完整取出髓核组织。以DMEM／F12培养液(含终浓度10万u／l的青霉素和终浓 度为0．1 液中37℃消化15—20rain，期间用吸管轻轻吹打，待组织大部消化、培养液浑浊后用100目不锈钢 网过滤。过滤后的细胞悬液1000 min。培养液漂洗3遍后混悬细胞，200目不锈钢滤网过滤。 g离心8 行台盼兰染色，观察细胞活力。细胞计数，以l×10／ml浓度接种到培养瓶中。生长培养液为(含15％ FBS的DMEM／F12液，pH7．0)，置于37℃、含5％的CO：温箱中培养。每天倒置显微镜观察细胞生长 情况，2d换液1次。 (二)细胞活力观测单层原代细胞接种前和传代时进行台盼蓝染色，将细胞用DMEM／F12和0．4 X ％台盼蓝溶液混悬成2 10／m1．吸取一定量悬液到平板计数器，倒置显微镜下计数4个大格蓝染和未染 色细胞，按细胞活力=未蓝染细胞数“未蓝染细胞数+蓝染细胞数)计算。 X1．0 (三)髓核细胞的鉴定将1．0cm载玻片放置到6孔培养板中，无菌条件下用多聚赖氨酸处 理载玻片，待载玻片在超净台中十燥后，将含细胞1×l0’的悬液种植到培养板中，进行爬片培养。14 U 照Chondrex公司C“染色试剂盒说明书操作。 (四)CHCS支架对体外培养髓核细胞生长和代谢的影响(1)实验分组：见表l。 表1 支架对体外培养髓核细胞生长和代谢影响研究的实验分组 334 第■膈脊柱外科学术沦坛 脊柱脊髓基础 (2)实验步骤：先将已制备的C cnl大小，鲫Co照射72 H／HyA—CS支架材料，剪成2．0×2．0×1．0 h消毒后．置入到底面积25elTl2的培养瓶中。原代培养的髓核细胞达到80％融合后，弃去培养液．加 入少量0．25％胰蛋白酶和0．01％EDTA混合液，消化细胞。倒置显微镜下观察，见细胞回缩，间隙增 大时．吸除消化液，加入适量含啦清的培养液终止反应，用吸管轻轻吹打瓶壁细胞。使之脱落形成细 胞悬液。1000