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RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程 　　（一）RNA提取 　　1、根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用1.5mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。 　　2、在生物安全柜内将采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）取100μL加入RLT液管中，充分混匀。 　　3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL 70%的乙醇，充分混匀。 　　4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记。取步骤（3）中的混合液600μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。 　　5、滤柱仍放回收集管上，将步骤（3）剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。 　　6、于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，离心15s。 　　7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，离心15s。 　　8、弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，离心2min。 　　9、将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上，向滤柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室温静置1~3min。 　　10、12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20以下保存。 　　注意：Buffer RPE使用之间加44mL无水乙醇。 　　（二）反应体系配制 　　1、实验设计： 　　检测标本RNA　 　　阴性对照：无菌水（标本RNA提取时，跟标本同时提取无菌水。） 　　阳性对照：已知病毒RNA 　　2、PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液） 　　1）按下表加入试剂： 　　PCR反应体系 　　 组 分 　　 体 积（μL） 　　 RNase Free Water 　　5×RT-PCR Buffer 　　 11.9×n 　　5×n 　　 10mM dNTP Mixture 　　 1×n 　　 Enzyme Mix 　　 1×n 　　 RNase Inhibitor 　　 0.1×n 　　 上游引物 　　 0.5×n 　　 下游引物 　　 0.5×n 　　 Total 　　 20×n 　　 　　对每一个建立的反应确定反应数（n=拟进行的PCR管数，包括阴性，阳性对）。考虑到阴性无模板对照，阳性对照，误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下： 　　（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1； 　　（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。 　　2）将上述反应液混匀，分装到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分别做好标记。 　　3）加RNA模板（在核酸提取区） 　　将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5μL无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。 　　3、RT-PCR反应 　　将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR 　　扩增，反应程序如下： 　　 温度 (C) 　　 时间 　　 循环数 　　 60 　　 1min 　　 1 　　 42 　　 10min 　　 50 　　 30min 　　 95 　　 15min 　　 94 　　 30s 　　 35 　　 52 　　 30s 　　 72 　　 1min 　　 72 　　 7min 　　 1 　　 4 　　 保存 　　 　　 　　4、RT-PCR产物检测 　　1）2.0％琼脂糖凝胶制备：称取2.0g Agarose，倒入耐热玻璃瓶内，再加入电泳液（1×TBE）100mL，轻轻混匀后加热，使Agarose完全熔化。待Agarose胶温度降至50～60左右，加入核酸染料，轻轻混匀（不要产生气泡）。待胶温度降至50左右时，将其倒入制胶板，插好电泳梳子。待胶完全凝固（约30～60min）之后，将梳子拔出。 　　2）将制备好的电泳胶放入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1×TBE）浸过胶面即可。 　　3）PCR产物各取10μL，加入2μL上样缓冲液（6×Loading Buffer），混匀后加入电泳胶孔内（先加Marker（DL－2000）5μL，然后依次加标本PCR产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。 　　4）电泳电压100V，约30～40min后看结果。 　　5）将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照