DNA提取原理和方法.pptVIP

极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，钠盐比游离核酸易溶于水。 在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。 提取DNA总的原则 : 1 保证核酸一级结构的完整性； 2 其他生物大分子的污染应降低到最低程度； 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。 　基因组DNA的提取 Approximately ~1 cm of tail is cut and put into an microfuge tube; Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and incubate at 55oC overnight or until tissue is dissolved; More Proteinase K may be added if digestion is not complete after 24 hr; Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for 15 min at RT; Spin at 13,000 rpm for 30 min at RT; Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube; Add 0.5 ml Chloroform and vortex at top speed for 5 min at RT; Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT; Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube, add 50 ml 3 M NaOAc (pH=6.0) and 0.5 ml 100% ethanol, invert several times; A NaOAc solution with pH lower than 6.0 will cause the EDTA to precipitate; Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT; If there is no pellet, place samples in -80oC for 10 min and spin at 13,000 rpm for 25 min at 4oC; Wash pellet once with 70% ethanol, air dry; Resuspend DNA in ddH2O. Use ~100-200 ml ddH2O to get final concentration as 100ng/ml for PCR. 非基因组DNA的提取 碱裂解法 密度梯度离心法 煮沸法 　质粒DNA的提取--碱裂解法 1、培养细菌使质粒扩增 ---对数生长后期 2、收集和裂解细菌 3、质粒DNA的纯化 1、培养细菌使质粒扩增 ---对数生长后期 在含有相应抗性的液体培养基中培养已转化质粒的细菌(单克隆)，使细菌快速增殖的同时质粒DNA得到大量扩增。 2、收集和裂解细菌 非离子型/离子型去污剂 裂解 有机溶剂/碱 加热 3 、质粒DNA的纯化 --- CsCl-溴化乙锭梯度密度离心 取决于线状DNA与闭环DNA与溴化乙锭结合的量 吸附柱 Spin Column with Collection Tubes 结构： 特殊硅基质吸附材料，特异性吸附DNA，而RNA与蛋白质穿过。 高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 大提小提 区别： 1. 大提可以用于大量菌液的提取，100ml-500ml 均可，而小提用的菌液量很少，一般1.5-5ml。 2.一般试剂盒中大提比小提多了溶菌酶、异丙醇