副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立初步应用.pdfVIP

福建省畜牧兽医学会2011年学术年会论文集 副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与初步应用 刘建奎①，杨小燕②，魏春华，李晓华，戴爱玲，杨兰秀 (龙岩学院生命科学学院，龙岩学院动物医学研究所， 福建省人畜寄生与病毒性疫病防控工程技术研究中心， 福建省预防兽医学与生物技术高校重点实验室，福建龙岩364000) [摘要]针对副猪嗜血杆菌16SrRNA序列设计1对特异性引物，能扩增出821bp的特异性DNA片段， 并据此建立了快速准确鉴定副猪嗜血杆菌PCR方法，临床试验证明该方法具有很好的特异性和敏感性。13 份疑似病料检测结果表明，PCR检测结果与传统生化鉴定结果符合率为100％。结果表明，成功建立了副猪 嗜血杆菌PCR检测方法，并可应用于临床副猪嗜血杆菌的检测。 [关键词]副猪嗜血杆菌；PCR；检测 副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，HPs)病 78 又称格拉泽氏病(GlasserDisease)。HPs是存在于1材料与方法 猪上呼吸道的一种常在菌，在特定条件下可以侵入 机体，引起以呼吸道症状为主的全身性疾病，以纤维 1．1菌株 素性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征【l。3j。该菌多 副猪嗜血杆菌血清4型菌株由本实验室分离并 与其他病原如猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病 保存。链球菌、巴氏杆菌和产肠毒素大肠杆菌 毒等混合感染，严重危害仔猪和青年猪的健康[4]。 (ETEC)由本实验室保存。 近几年来副猪嗜血杆菌病在猪场不断发生，已趋于 1．2主要试剂 流行，发病率和死亡率均呈显著上升趋势…。 胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基和胰蛋白胨大 由于副猪嗜血杆菌营养要求比较苛刻，一般从 豆肉汤培养基(TSB)购于北京陆桥技术有限责任公 病料中分离率较低L5 司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)购于成都贝斯特 J，使病原学诊断方法受到一定 Marker 的限制。常规的血清学诊断方法存在操作繁杂、费 DNA聚合酶和DL2000 试剂有限公司；rTaq 时费力、敏感性低和特异性低等不足MJ，和常规的诊 为宝生物工程(大连)有限公司产品。 断方法相比PCR具有检测快速、特异强、敏感性高 1．3引物设计与合成 7一 的优点。因此，建立HPsPCR快速准确的诊断方法， 参照文献【_¨的方法设计引物。上游引物为：5 7 GTGATGAGGAAGGGTGGT 对HPs的防治具有重要意义，并为其流行病学调查 GT一3，．下游引物为：5 提供技术手段。 bp，由上海生工生物科技有限公司合成。 ①刘建奎，硕士，山东聊城人，主要从事分子病原学研究，liujiankui99@126．tom ②通讯作者：杨小燕，E—mail：lyyxyl988@126．corn ·78· Ⅻ*嗜m#茼IqⅢ＆Ⅻ}*日《is，Ⅱ月 4HPs的分离培养与生化鉴定按立献川的方较分析。 法进行。 I 5PcR模板处理 副猪嗜血杆菌血清4型荫株在鸭A培养基上增 殖后，用接种环挑取可疑单一菌落，溶于40ⅡL