基因Ⅶ型新城疫病毒SYBR+GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用.pdfVIP

第二届全国禽病分子生物技术青年学者论坛论文集 Green 基因Ⅶ型新城疫病毒SYBR I实时荧光定量PCR检测方 法的建立及初步应用 孟春春1段云兵2仇旭升，金仕强3，詹媛1，张向乐1，于圣青1，丁铲1。 (中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；2．南京农业大学动物医学学院，南京210095； 3．四川农业大学动物医学学院，雅安625014) 摘要：根据Ⅶ型新城疫病毒基质蛋[J基因保守序列设计并合成特异性引物，建立快速检测Ⅶ型 新城疫病毒的实时荧光定量RT．PCR方法。通过RT．PCR方法克隆Ⅶ型新城疫病毒M基因靶序列并 将其连入T-Easy载体，制备阳性标准品，优化反应条件，以10倍系列稀释的标准品绘制标准曲线， 其相关系数为0．999。检测结果显示，该方法的灵敏度可达100copies／l咀L。而且特异性良好，除Ⅶ型 新城疫病毒外．对II型、III型、Ⅸ型新城疫病毒、H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、鸡传染 性支气管炎病毒检测结果均为阴性。该方法重复性好，批内和批间变异系数均小于3％。对40份实 验感染样品的检测结果表明，该方法比常规RT-PCR检测方法灵敏度更高、特异性更强． Green 关键词：VII型新城疫病毒；SYBRI：实时荧光定量RT-PCR andvalidationofrealtimeSYBRGreenIfluorescence RT．PCR Design quantitative fordetectionof Newcastlediseasevirus assasy genotypeⅥI Abstract：TherealtimeSYBRGreenI fluorescence reverse chain quantitativetranscriptionpolymerase basedonconservedofmatrixWas for detectionof developed reaction(rRT-PCR)assayregion gene rapid VIINewcastlediseasevirus．ne ofM Wasclonedintothe vector genotype targetsequencegene T-easy andaseriesofdilutedrecombinantwereusedto standardcurve．TherRT—PCRhas plasmids generate assay 100 a of0．999．The adetectionlimitof of RNA andcorrelationcoefficient copiestarget per-reaction assay with showed anddidnotcrossreact otherviruses 900dspecificity includinggenotype(II，IV，IX) virusandInfectionbronchitisvirus． Newcastledisease Avia