Percoll密度梯度离心分离不同发育阶段生精细胞的方法1).pdfVIP

遗传 HEREDITAS(Beijing)9(6);33-3519脸 实 验 技 术 Percoll密度梯度离心分离不同发育 与 阶段生精细胞的方法’‘ 方 法 吴 舞 蒋耀青 （中国科学院遗传研究所，北京） 精子发生过程是生命周期中的重要过程， 保温40分钟，不时用吸管吹打细胞，使之易于 也是研究高等动物细胞分化的一个独特体系。 分散。镜检见细胞已分散开时，加小牛血清至 由于精子发生这一连续过程是在皋丸组织中完 终浓度为8摇。冰箱内冷却10分钟，用二层细 成的，所以不同发育阶段的生精细胞彼此共存， 尼龙网过滤除去小块状物，1000转／分离心10 而要进行有关的生化研究，必须得到均一的处 分钟，收集细胞沉淀，用 PBSG洗两次 每（次 于某一特定发育阶段的生精细胞。 因此，如 1000转／分，离心10分钟）。最后按每1克组 何从翠丸组织中分离出特定发育时期的生精细 织20毫升 PBSG的比例加人 PBSG，同时补 胞，是进行深人研究的首要条件。 加 DNaseI(DN-25,Sigma公司产品）和 精子发生过程中，由于各类细胞的浮力密 MgC1, 终（浓度分别为 17微克 ／毫升和1mm), 度不同，因此，可以利用密度梯度离心的方法 以得到分散的细胞悬液，用于密度梯度离心。 将不同密度的细胞分离开来[7,［87。本文采用以 三（）Percoll不连续密度梯度离心 Percoll为介质的不连续密度梯度离心方法，从 参考Meistrich的方法10〔]，并作适当改进。 小鼠辜丸组织中分离出均一性较好的精母细胞 Percoll(Pharmacia公司产品）贮备液 （密 和精细胞。 度 1.134克／厘米，），用水和1/10体积的10倍 浓度的PBSG稀释至所需浓度，并加入 Mgclz 材 料 和 方 法 和 DNaseI至终浓度分别为 1MM 和 100微 一（）取材 选用雄性性成熟昆白小鼠 克／毫升，这就是离心时用的梯度工作液。用注 （由本所动物中心提供），体重35-45克。用断 射器取不同浓度的 Percoll工作液，按密度从 颈法处死动物，取出塞丸，置于预冷的磷酸盐蔗 大到小的顺序，由管底向上一层一层地依次叠 糖缓冲液 P（BSG）中。剥离结缔组织、外层包 加，注意不得破坏二梯度间的界面。最后铺成 膜及毛细血管后称重，加少量 PBSG，理出曲 5层界面清晰的不连续密度梯度。每个离心管 细精管，经二层细尼龙网过滤，去掉间质细胞， 共装10毫升梯度介质，Percoll的浓度梯度为 收集尼龙网上的曲细精管。 30外,25务,22多,17关,15多。将2毫升待分离 二（）皋丸细胞悬液的制备 参考黄均 的攀丸细胞悬液 约（6X106-6X10，个细胞） 蓉1z，和MeistrichE91o，的方法，作适当改进。按 WitJianetal.:SeparationofMouseSpermatogenic 1克组织20毫升的比例，加人预冷的 PBSG, CellsbyCentrifugationinPercollDensity Grad- 用剪刀或刀片将曲细精管剪成小段，在电磁搅 tents 1)本工作曾得到黄华裸、林友刚，孙海源等同志的支持， 拌器上以约120转／分的速度室温搅拌 10分 特此致谢。 钟，然后加胰蛋白酶 使（终浓度为0.4务），370C 本文于1986年3月29p收到。