2011年度报告.doc

2011年度报告解析了羰基还原酶ScCR和环氧水解酶BMEH的晶体结构，为后续研究外在因素对酶构象变化影响奠定了基础。2.1 巨大芽孢杆菌环氧水解酶的克隆表达和表征 （1）巨大芽孢杆菌环氧水解酶基因挖掘 我们依据目前报道的环氧水解酶保守区域，自己预测巨大芽孢杆菌环氧水解酶基因，并成功克隆了环氧水解酶BMEH，大小约为34 kDa。经测定纯酶的比活达到83 U/mg protein，高于枯草芽孢杆菌EH (0.01 U/mg protein)和农杆菌EH (11 U/mg protein)。据我们所知，BMEH对于PGE的活性是目前发现的微生物环氧水解酶中最高的(Adv. Synth. Catal. 2011, 353: 1510-1518)。 （2）底物结构对巨大芽孢杆菌环氧水解酶选择性的影响 通过对BMEH底物谱的研究，发现BMEH对于模型底物苯基缩水甘油醚(1)的对映选择性和野生型巨大芽孢杆菌整细胞一样，都是反常规的(R)-选择性，且E值达到58。据我们所知，这是目前对于该底物选择性最高的一种天然EH。进一步拓展不同的缩水甘油醚类底物，发现苯环上不同的取代基团和取代位置对BMEH的活性和选择性影响非常明显。苯环上有取代基团以及侧链变长或增大都会明显降低BMEH的活性，其中硝基取代时BMEH的活性比甲基取代时更低。苯环上取代基的位置从邻位到对位时，BMEH的对映选择性也逐渐变小。 出乎意料的是，邻位硝基取代时(5)对映选择性竟然与间位硝基取代时(6)的相反，但BMEH对它们的E值都大于200。通过测定BMEH对底物2~5的区域选择性因子，发现BMEH一般主要进攻取代基较少的C1，但对于底物5的两种异构体，却主要进攻取代基较多的C2位置。利用分子对接技术，在分子水平上解释了BMEH对于底物5的对映选择性发生转换的原因(Adv. Synth. Catal. 2011, 353: 1510-1518)。Docking研究过程中发现，反应较快的对映体具有相对较低的结合自由能(ΔG)，较短的距离(d value)以及较大的角度(α1和α2)，这符合NACs假说。 表 环氧水解酶BMEH水解环氧化物1~16的结果Substrate Concentration Enzyme used (U) [a] Time ees (%) [b] Conversion E value [d] (mM) (min) / Config. (%) [c] 1 20 8 2 99/ (S) 56 58 2 10 9 30 99/ (S) 50 200 3 10 9 30 77/ (S) 50 19 4 10 9 50 73/ (S) 52 11 5 10 18 150 99/ (R) 50 200 6 10 18 30 99/ (S)[e] 50 200 7 10 108 120 67/ (S) 54 7 8 10 18 30 87/ (S)[e] 52 25 9 10 18 120 77/ (S) 69 4 10 10 108 120 98/ (S) 58 25 11 5 400 5 99/ (R) 51 200 12 5 400 30 53/ (R) 57 4 13 5 4 2 39/ n.d.[f] 51 3 14 5 400 10 31/ (R,R) 54 2 15 20 8 5 20/ (2S,3R) 67 1.4 16 10 400 8 60/ (2S,3R) 70 3 [a] Lyophilized enzyme powders or cell-free extracts were used for substrates 1~10 and 11~16, respectively. [b] Determined by chiral HPLC or GC as described in Table 4.2. [c] Conversion was determined as described in 2.1.6. [d] E values were calculated by the following equation: E=ln[(1-c)(1-ees)]/ln[(1-c)(1+ees)]. [e] The absolute configurations were confirmed by comparing the optical rotations reported in the literature. [f] n.d.: not determined. 研究了BMEH对于其它类型具有代表性的环氧化物的水解效果，遗憾的是BMEH对于它们的选择性基本上都很低(E 10)，但对于对硝基苯乙烯氧化物1