RAPD分子标记技术.pptVIP

分子标记的类型 ①基于杂交的分子标记，如RFLP（Restriction fragment length polymorphism,即限制性长度片段多态性）。 ②基于 DNA序列和芯片的分子标记，如SNP（Single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性）。 ③基于 PCR的分子标记，它又分为两类： RAPD （Random amplified polymorphic DNA） DAF（DNA amplification fingerprinting） SSCP（Single strand confirmational polymorphism） 小卫星DNA（Minisatellite DNA） 微卫星DNA（Microsatellite DNA）,又称SSR（Simple sequence repeat） ISSR（Inter simple sequence repeat） AP-PCR（Arbitrary primer PCR） 它主要有SCAR（Sequence characterized amplified region） STS (Sequence tagged site) 　 （1）随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD） 简介：RAPD是由Williams和Welsh（1990）同时发展起来的一项新的建立于PCR实验基础上的检测基因组DNA多态性的遗传标记技术。 原理：该技术利用大量的、各不相同的，碱基顺序随机排列的寡聚单核苷酸链为引物(约8～10 个碱基) ，以待研究的基因组DNA片段为模板，进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，可对基因组DNA进行多态性分析。 RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物3’端相距在一定的长度范围内，就可以扩增出DNA片段。 一旦基因组在这些区域发生DAN片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。 PCR RAPD RAPD RAPD RAPD RAPD Separated RAPD Fragments 1.模板DNA的制备与调整 　根据实验材料的不同，采用相应的DNA提取方法提取基因组总DNA（gDNA）DNA沉淀经溶解稀释后琼脂糖凝胶电泳检测OD值，确定提取的质量和浓度，最后将合格的ＤＮＡ提取液浓度调整一致，－２０℃保存备用。 2.ＰＣＲ各组分的混配 按照反应体系各组分的反应比例，充分、迅速、有序的添加各种成分，一般家加样顺序：模板25ng、引物15ng、dNTP0.1mm、10×反应缓冲液2微升、氯化镁2mm,最后加入Taq酶，以双蒸水补充体积至25微升，混匀后20微升矿物油覆盖。 3.DNA扩增 将盛放以上各组分的离心管放在DNA扩增仪上按反应程序设定进行DNA扩增，经过35—45个循环，将ng级的模板DNA扩增到mg级。 4.扩增产物的分离检测和记录 扩增结束后，采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分离，电极缓冲液采用1×TAE（0.04M Tris-乙酸、0.001M EDTA） 电压80—100V。电泳结束后，凝胶放入0.5%EB染色20—30min，然后放在中等波长紫外光下观察记录、照相。 综上，ＲＡＰＤ操作过程概括如下： RAPD标记的主要特点有： （1）不需DNA探针，设计引物无须知道序列信息； （2） DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低； （3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术； （4）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子； （5）实验重复性较差，结果可靠性较低。 ＲＡＰＤ标记的应用 ＲＡＰＤ标记具有快速、安全、简便、灵敏的特点，在杂交育种中，尤其在林木果树等多年生植物的杂交育种中，用于分子标记辅助选择（MAS）的早期鉴定，从而大大缩短育种年限，加速育种进程。 此外，RAPD已在遗传图谱构建、种质资源分析、基因标记等方面得到了广泛的应用。 * * 位点特异的PCR标记方法 多位点标记方法 基于PCR技术的DNA扩增方法 R