实验六、反相高效液相色谱法测定尼泊金甲酯.doc

实验六、反相高效液相色谱法测定尼泊金甲酯 实验目的 1、了解高效液相色谱仪的基本结构及基本操作。 2、了解反相色谱法的基本原理，掌握反相色谱法分离尼泊金甲酯的方法。 3、掌握利用内标法进行色谱定量分析的实验方法。 实验原理 1、对羟基苯甲酸甲酯，又叫尼泊金甲酯，白色结晶粉末或无色结晶，易溶于醇，醚和丙酮，极微溶于水，沸点270-280℃。 主要用作有机合成、食品、化妆品、医药的杀菌防腐剂，也用作于饲料防腐剂。 由于它具有酚羟基结构，所以抗细菌性能比苯甲酸、山梨酸都强。其作用机制是：破坏微生物的细胞膜，使细胞内的蛋白质变性，并可抑制微生物细胞的呼吸酶系与电子传递酶系的活性。 进样装置 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示： 6、定性方法： 1）利用纯物质定性的方法 利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。 利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。 （2）利用文献保留值定性 7、常用的几种定量方法 （1）归一化法：若试样中含有n个组分，且各组分均能洗出色谱峰，则其中某个组分的质量可按下式计算 归一法特点及要求： 归一化法简便、准确； 进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大； 仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。 （2）内标法：在一定试样中加入一定量的内标物，根据待测组分和内标物的峰面积及物质量计算待测物质质量的方法。 内标物要满足以下要求： 试样中不含有该物质； 与被测组分性质比较接近； 不与试样发生化学反应； 出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰影响。 试样配制：准确称取一定量的试样W，加入一定量内标物mS 计算式： 内标法特点 内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大。 每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分析。 若将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定， 则： 外标法：外标法也称为标准曲线法。 特点及要求： 外标法不使用校正因子，准确性较高; 操作条件变化对结果准确性影响较大; 对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。 实验仪器与试剂 1、色谱仪：Agilent 1100 2、色谱柱：C18柱， 250 mm×4.6 mm，柱长：75mm 3、流动相：甲醇:水(70:30)，流速：1.0 mL/min 4、检测器：紫外检测器 254 nm 四、实验基本操作 1、打开电脑主机，再打开高效液相色谱的模块，启动工作站并初始化仪器。 2、仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：流动相组成=甲醇:水(70:30) ，流速=1.0 mL/min ，柱压=200 kPa。 3、运行程序，清洗色谱柱，直至基线平稳，然后进样，进行测定。 4、测定结束后，依次用纯水、100%甲醇洗涤20分钟，退出主程序，关闭计算机。 五、实验步骤 1、确定实验条件（流动相、流速、检测波长等） 2、溶液的配制：以流动相为溶剂，表样储备液（0.10mg·mL-1）为原液配置浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg·mL-1的标准溶液。 3、 标准曲线制作：待仪器稳定后，依次进样20μL已知溶液，记录色谱图及保留时间tR。 4、样品分析：注入20μL未知液，记录色谱图及各组分保留时间tR’。 六、实验数据分析 1、表一：一系列尼泊金甲酯标准溶液保留时间及其峰面积： 浓度（mg·mL-1） 保留时间（min） 峰面积 0.02 1.174 2294127 0.04 1.172 4409102 0.06 1.176 7703425 0.08 1.175 9927346 0.10 1.174 根据表一中数据制得尼泊金甲酯的标准曲线图： 图中由于0.1mg·mL-1尼泊金甲酯溶液所测得的峰面积数据有问题，故舍弃。 2、以下是分离未知样品所得色谱图： 根据分离未知液所得色谱图及表一中的数据可知，保留时间为1.175min的峰是尼泊金甲酯的峰，峰面积为8180844μv/s，由测得的峰面积在标准曲线上可求出被测组分尼泊金甲酯的浓度为0.0665mg/mL。 1