猪胚胎干细胞培养、分离与传代.pdfVIP

维普资讯 生 堇 堂报 JournalofAgriculturalBiotechnology 2003，11(3)：263-267 · 研究论文 · 猪胚胎干细胞培养 、分离和传代 木 董 晓 。 冯书堂 王 占贺 王端云 郑 行 (1．中国农业科学院畜牧研究所，北京 l00094；2．北京农学院，北京 102206；3．中国农业大学生物学院 ．北京 100094) 摘要：利用五指山小型猪近交系不同发育阶段的早期胚胎为材料 ，探索猪胚胎干细胞 (embryonicstemcells，ES)培养 、分离 、 传代的影响因素，以选择猪胚胎干细胞建系的适宜条件：收集五指山猪第 5～l0d胚胎(配种当天记为 0d)，以STO细胞 [STO细 胞是来 自SIM 小 鼠(s)胚胎对硫代鸟嘌呤(thioguanine，T)和乌本苷 (ouabain，0)有抗性 的成纤维细胞系]为饲养层 ，分别采用两种 培养液：杜 氏培养液 (Dulbecco’smodifiedeaglemedium ，DMEM)+10％胎牛血清 (fetalbovineserum，FBS)+l0％新生牛血清 (newbornbovineseurm，NBS)+l000IU／mL 白血病抑制 因子 (1eukemiainhibitory factor，LIF)+30ng／mL十细胞生 长因子 (stemcellgrowthfactor，SCF)+20ng／mL碱性成纤维细胞生长 冈子 (basicfibroblastrgowthfactor，bFGF)或 DMEM+l0％NBS +l0％FBS+l000IU／mLLIF+30ng／mLSCF。比较发现，培养液中是否加入 bFGF对胚胎干细胞 的培养无显著影响 ；实验共收 集胚胎 124枚 ，其 中D5～6胚胎 l8枚 ，胚胎贴壁率为 68．8％，内细胞团出现率为 6．3％，未能传代 ；收集 D7孵化囊胚 27枚 ，贴 壁率为 l00％ ，内细胞团出现率为38．9％ ，传代 1次失败 ；D9胚胎 18枚 ，贴壁率为 l00％，传代后 ES细胞生长较缓慢 ；收集 D10胚胎 52枚 ，胚胎贴壁率为 l00％，传代率为 l00％，传代后可出现 ES细胞克隆点 ；实验过程中比较 了胚径对干细胞培养的 影响，发现胚径越大，培养效果越好 ，胚径大于 lo0 m，分离 ICM 后出现干细胞集落成功率达 100％，并得到了AP染色呈 阳性 的传4代的 ES细胞集落。 关键词 ：猪 ；胚胎干细胞；生长因子 Culture，IsolationandPassageofPorcineEmb~onicStem Cells DongXiao 。 FengShutang W angZhanhe。 W angDuanyun ZhengXing3 f1．hastiutteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculutralScience，Beijing100094，China；2．BeijingAgriculutralCollege Beijing102206，China；3．CollegeofBiologicalSciences，ChinaAgriculutralUniversity，Beijing100094，China) Ab曲c蛾 Embryonicstem fES) cellsarepluripotentialcellsisolatedrfom culutreofpreimplantationembryosm vitro． Experimentswereundertakentoidentifypreimplantationembryonicsatgesandculutreconditionsunderwhichpluripotentialporcine embryo．derivedcelllinesc