实时荧光定量PCR技术的研究进展和应用.pdfVIP

氨基酸和生物资源 2011，33(2)：68～72 AminoAcids＆B0f Resources 实时荧光定量 PCR技术的研究进展与应用 钟江华，张光萍，柳小英 (武汉大学后勤集团，武汉 430072) 摘要：实时荧光定量PCR技术 (real—limefluorescentquantitativePCR，FQ一 R)以其特异性强 、灵敏度高、重复 好、定 量准确 、自动化程度高、速度快 、全封闭反应等优点在人类和动物疾病的快速检测、食品安全检测、定量分析 、耩因分型、基 表达研究、以及疫苗效力测定中成为分子生物学研究的再要 具，而且其定量范围橄宽，无需做梯度稀释，特异性更强，克服 了假阳性。本文分别从实时荧光定量PCR技术的背景、原理、类型、技术优点和定量方法 、实验条件和t要影响因素、应朋前 景以及存在的不足等方面作 丫一个综述。 关键词 ：荧光定量 ；PCR；原理 ；应用 中图分类号：Q53 文献标识码：A 文章编号 ：1006—8376(2011)02—0068—05 随着基因诊断技术 的不断发展和成熟 ，基 诊 标记在探针的5端荧光报告基 (reporterR)未被 断在临床 中的地位显得更为重要。实时荧光定量 标记在3端淬灭摹团 (quencherQ)抑制时，可检测 PCR(real—timefluorescentquantitativepolymerase 到报告摹团的荧光信号。检洲到的荧光信号的强度 chainreaction。real—timeFQ—PCR)技术于 1996年 与PCR反应产物的量成It-PPl父，即何扩增一条DNA 由美国AppliedBiosystems公司推m，}{1于该技术不 链 ，就有 一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积 仅实现 了PCR从定性到定量的飞跃 ，而且与常规 与PCR产物的形成完全同步 PCR技术相 比它所具有的特异性强、灵敏度商、重 1．2 定量 原理 复性好、定量准确、自动化程度高、速度快、全封l=4．J反 1中x—j1It表示 PCR循环数 ，Y一轴表爪扩增 应等优点使其很快成为科研、临床诊断的热点技术， 反应的荧光值 ，与反应管I{|扩增产物的量有 比例关 目前 已得到广泛应用，包括对 mRNA表达 的研究、 系。扩增曲线仃指数增长期干¨非指数平台期 2个阶 各种基 因定量分析、点突变分析和等位基 因分析 、 段 。在指数增长阶段 ，每个循环 PCR产物量大约增 核苷酸多态性分析、DNA甲基化的检测及对各种传 加u一倍 。然而随着反应的进行，反应体系组成成分 染病进行定量定性分析。 的消耗 ，反心进入平台期 ( 1f【】28～40个循环)。 1 实时荧光定量PCR技术原理 一 实时荧光定量 PCR技术，是指在 PCR反应体 ” ／ Non- 系中加入荧光基团，利用荧光信 号积累实时监测整 ／ 个 PCR进程 ，最后通过标准曲线对未知模板进行定 兰02 量分析的方法。 舅 1·1 工作原理 ： ()1 在常规 PCR基础上添加 _r荧光染料或荧光探 一 针。而用于常规 PCR的专门热循环仪配备荧光检 一 ． ． ． 一 测模块，可监测扩增时的荧光。荧光染料能特异性 1O 掺人 DNA双链，发出荧光信号，而不掺入双链中的 染