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大肠杆菌宿主菌蛋白质残留量.docVIP

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页号:1/4 江苏金丝利药业有限公司 操作规程 题 目 大肠杆菌宿主菌蛋白质残留量检验标准操作规程 编 号 QC-OS-026-06 复 印 号 制 定 人 审 核 人 批 准 人 制定日期 审核日期 批准日期 颁发部门 质检部 生效日期 分发部门(岗位):档案室、生产部、质检部、理化检测2 修订原因及目的:对配液及具体操作进行细化完善。 标题:进一步加强注射用重组人白介素-2原液大肠杆菌残留量的控制注射用重组人白介素-2原液大肠杆菌残留量的测质部经理、人员 一 制订依据:《中国药典》20年版三部。 简述:利用酶联免疫法测定大肠杆菌残留量,将兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体包被,结合菌体蛋白,再和有辣根过氧化酶标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体结合,加入底物,产生的物质在492nm处测吸光度,与参考品的标准曲线对照,即可得原液中菌体蛋白的含量。 二 规程: 1 仪器与用具 CS-9301PC型酶标仪 日本岛津制作所。 96孔细胞培养板。 37℃恒温培养箱。 1. BCD-180WD型冰箱 上菱冰箱厂。 1. 移液枪 。 2 试药与试液 2.1 实验材料 所需化学试剂均应分析纯。 2.2 包被液(pH9.6碳酸盐缓冲液) 称取碳酸钠0.32g,碳酸氢钠2/4 江苏金丝利药业有限公司 操作规程 0.586g,置200ml量瓶中加水溶解并稀释至刻度。2.3 磷酸盐缓冲液(pH7.4) 称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g(相当于Na2HPO4·12H2O 3.63g,Na2HPO4·12H2O磷酸氢二钠占比39.7%)、磷酸二氢钾0.24g,加水溶解稀释至500ml,121℃灭菌15分钟。 2.4 洗涤液(pH7.4) 取聚山梨酯20 0.5ml,加磷酸盐缓冲液至500 ml 2.5 稀释液(pH7.4) 称取牛血清白蛋白0.5g,加洗涤液溶解并稀释至100 ml2.6 浓稀释液 称取牛血清白蛋白1.0g,加洗涤液溶解并稀释至100 ml 2.7 底物缓冲液(pH5.0枸橼酸-磷酸盐缓冲液) 称取磷酸氢二钠 (Na2HPO4·12H2O)1.84g,枸橼酸0.51g,加水溶解并稀释至100ml 2.8 底物液 取邻苯二胺8mg,加30%过氧化氢30μl,溶于底物缓冲液20ml中临用时现配。 2.9 终止液 1mol/L硫酸溶液2.10 兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体℃冰箱保存,有效期按标签规定执行。每次实验前取4μl,在刻度试管中用包被液稀释至4ml(稀释1000倍),制成10μg/ml抗体。 2.11 辣根过氧化酶(HRP)标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体1ml)。于2~8℃冰箱保存,有效期为6个月,-20℃保存,有效期更长。每次实验前取4μl,在刻度试管中用稀释液稀释至4ml(稀释1000倍)。 2.12 标准品溶液的制备品204 μg/支,4℃保存,由中国药品生物制品检定所提供。品用1ml纯水溶解,再用稀释液定容至10ml,分装至0.5 ml EP中,装量为0.1ml/管,4℃保存,有效期为一周-20℃保存,有效期为6个月在配制记录中明确其配制批号,其格 编号:QC-OS-026-06 页号:3/4 江苏金丝利药业有限公司 操作规程 式为:CP+年份+月份+。如配制批号为CP,则表明是20年月配制的菌体蛋白溶液,及时填写配液记录。2.13 供试品溶液的制备 取供试品适量,用稀释液稀释成每1ml约含250μg的溶液。如供试品每1ml中含量于500μg时,用浓稀释液稀释一倍(即稀释倍数为2)。3 操作方法3.1 包被 酶标板96孔酶标板用包被液稀释兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体至10μg/ml,以100μl/孔加至96孔酶标板内, 4℃放置过夜(16~18小时)。 3.2 封闭 用洗涤液洗板3次,用洗涤液制备1%牛血清白蛋白,以每孔200μl加至板内,置37℃2小时。 3.3 将封闭好的酶标板用洗涤液洗涤3次。3.4 加样3.4.1 菌体蛋白品稀释 用稀释液稀释菌体蛋白品至下列浓度:500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml、7.8125ng/ml。具体方法:取已配制好的菌体蛋白品1管(0.1ml/管),其浓度为20.4μg/ml

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