大肠杆菌宿主菌蛋白质残留量.docVIP

页号：1/4 江苏金丝利药业有限公司 操作规程 题 目 大肠杆菌宿主菌蛋白质残留量检验标准操作规程 编 号 QC-OS-026-06 复 印 号 制 定 人 审 核 人 批 准 人 制定日期 审核日期 批准日期 颁发部门 质检部 生效日期 分发部门（岗位）：档案室、生产部、质检部、理化检测2 修订原因及目的：对配液及具体操作进行细化完善。 标题：进一步加强注射用重组人白介素-2原液大肠杆菌残留量的控制注射用重组人白介素-2原液大肠杆菌残留量的测质部经理、人员 一 制订依据：《中国药典》20年版三部。 简述：利用酶联免疫法测定大肠杆菌残留量，将兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体包被，结合菌体蛋白，再和有辣根过氧化酶标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体结合，加入底物，产生的物质在492nm处测吸光度，与参考品的标准曲线对照，即可得原液中菌体蛋白的含量。 二 规程： 1 仪器与用具 CS-9301PC型酶标仪 日本岛津制作所。 96孔细胞培养板。 37℃恒温培养箱。 1. BCD-180WD型冰箱 上菱冰箱厂。 1. 移液枪 。 2 试药与试液 2.1 实验材料 所需化学试剂均应分析纯。 2.2 包被液（pH9.6碳酸盐缓冲液） 称取碳酸钠0.32g，碳酸氢钠2/4 江苏金丝利药业有限公司 操作规程 0.586g，置200ml量瓶中加水溶解并稀释至刻度。2.3 磷酸盐缓冲液(pH7.4) 称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g（相当于Na2HPO4·12H2O 3.63g，Na2HPO4·12H2O磷酸氢二钠占比39.7%）、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解稀释至500ml，121℃灭菌15分钟。 2.4 洗涤液（pH7.4） 取聚山梨酯20 0.5ml，加磷酸盐缓冲液至500 ml 2.5 稀释液（pH7.4） 称取牛血清白蛋白0.5g，加洗涤液溶解并稀释至100 ml2.6 浓稀释液 称取牛血清白蛋白1.0g，加洗涤液溶解并稀释至100 ml 2.7 底物缓冲液（pH5.0枸橼酸-磷酸盐缓冲液） 称取磷酸氢二钠 （Na2HPO4·12H2O）1.84g，枸橼酸0.51g，加水溶解并稀释至100ml 2.8 底物液 取邻苯二胺8mg，加30%过氧化氢30μl，溶于底物缓冲液20ml中临用时现配。 2.9 终止液 1mol/L硫酸溶液2.10 兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体℃冰箱保存，有效期按标签规定执行。每次实验前取4μl，在刻度试管中用包被液稀释至4ml（稀释1000倍），制成10μg/ml抗体。 2.11 辣根过氧化酶（HRP）标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体1ml）。于2~8℃冰箱保存，有效期为6个月，-20℃保存，有效期更长。每次实验前取4μl，在刻度试管中用稀释液稀释至4ml（稀释1000倍）。 2.12 标准品溶液的制备品204 μg/支，4℃保存，由中国药品生物制品检定所提供。品用1ml纯水溶解，再用稀释液定容至10ml，分装至0.5 ml EP中，装量为0.1ml/管，4℃保存，有效期为一周-20℃保存，有效期为6个月在配制记录中明确其配制批号，其格 编号：QC-OS-026-06 页号：3/4 江苏金丝利药业有限公司 操作规程 式为：CP+年份+月份+。如配制批号为CP，则表明是20年月配制的菌体蛋白溶液，及时填写配液记录。2.13 供试品溶液的制备 取供试品适量，用稀释液稀释成每1ml约含250μg的溶液。如供试品每1ml中含量于500μg时，用浓稀释液稀释一倍（即稀释倍数为2）。3 操作方法3.1 包被 酶标板96孔酶标板用包被液稀释兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体至10μg/ml，以100μl/孔加至96孔酶标板内， 4℃放置过夜（16~18小时）。 3.2 封闭 用洗涤液洗板3次，用洗涤液制备1%牛血清白蛋白，以每孔200μl加至板内，置37℃2小时。 3.3 将封闭好的酶标板用洗涤液洗涤3次。3.4 加样3.4.1 菌体蛋白品稀释 用稀释液稀释菌体蛋白品至下列浓度：500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml、7.8125ng/ml。具体方法：取已配制好的菌体蛋白品1管（0.1ml/管），其浓度为20.4μg/ml