微遗传学实验指导-2012新.docVIP

微生物遗传学实验指导 大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变筛选和鉴定 1. 实 验 原 理 在以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理细菌，使基因发生突变，丧失合成某一物质（如氨基酸、维生素、核苷酸等）的能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长。这样从野生型经诱变筛选得到的菌株，称为营养缺陷型。筛选营养缺陷型菌株必须经过以下几个步骤：诱变处理、淘汰野生型、检出缺陷型、鉴定缺陷型。由于本实验是以大肠杆菌为材料，所以根据细菌的特性分别说明筛选的步骤。 诱变剂的作用主要是提高突变频率，它分为物理和化学的二类。物理诱变剂常用的有X射线、紫外线、快中子、γ射线等。诱变处理首先是选择诱变剂，微生物诱变中最常用的物理诱变剂是紫外线。 用诱变剂处理微生物，一般要求呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液，分布均匀，这样可以避免出现不纯的菌落。用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，处于该期的细菌对诱变剂最敏感。 必须选择合适的剂量进行诱变处理，剂量的表示有二种，绝对剂量和相对剂量。绝对剂量的单位以尔格/cm2表示，一般用相对剂量。相对剂量与3个因素有关：诱变源和处理微生物的距离、诱变源（紫外灯）的功率、处理的时间。前2个因素是固定的，所以通过处理时间控制诱变剂量。处理不同微生物的最适剂量是不同的，须经预备实验确定。 经处理以后的细菌，缺陷型还是相当少的，必须设法淘汰野生型细胞，提高营养缺陷型细胞所占比例，以达到浓缩缺陷型的目的。细菌中常用的浓缩法是青霉素法。青霉素只杀死生长的细胞，对不生长的细胞没有致死作用。所以在含有青霉素的基本培养基中野生型能够生长而被杀死，缺陷型不能生长被保存得以浓缩。 检出缺陷型的方法有逐个测定法、夹层培养法、限量补给法、影印培养法。这里主要以逐个测定法为例进行说明。把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全培养基上，待长出菌落后将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上。凡是在基本培养基上不能生长而在完全培养基上能长的菌落就是营养缺陷型。 经初步确定为营养缺陷型的菌用生长谱法鉴定。在同一培养皿上测定一个缺陷型对多种化合物的需要情况。 2. 实 验 材 料 大肠杆菌K12的野生型菌株大肠杆菌（Escherichia coli）K12SF+。 3. 实验器具和药品 3.1. 用具 灭菌培养皿（9cm），灭菌三角烧瓶（250 mL），灭菌枪头（蓝、黄），灭菌离心管。 3.2. 培养基 （1） 肉汤液体培养基(CM)：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，蒸馏水100mL，pH 7.2，高压灭菌0.1Mpa, 15min。 （2）肉汤液体培养基(CM2X)：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，蒸馏水50mL，pH 7.2，高压灭菌0.1Mpa, 15min。 （3）基本液体培养基：Vogel 50×2mL，葡萄糖2g，蒸馏水98mL，pH 7.0，高压灭菌0.06Mpa, 15min。 （4）基本固体培养基：琼脂2g，基本液体培养基100mL，pH 7.0，高压灭菌0.06Mpa, 15min。 （5） 无N基本液体培养基MM(-N)：K2HPO4 0.7g（或K2HPO4·3H2O 0.92g），KH2PO4 0.3g，柠檬酸钠·3 H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，葡萄糖2g，蒸馏水100mL，pH 7.0，高压灭菌0.06Mpa, 15min。 （6） 2N基本液体培养基MM(2N)：K2HPO4 0.7g（或K2HPO4·3H2O 0.92g），KH2PO4 0.3g，柠檬酸钠·3 H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，(NH4)2SO4 0.2g，葡萄糖2g，蒸馏水100mL，pH 7.0，高压灭菌0.06Mpa, 15min。 （7） 氨基酸、维生素和核苷酸的配制：精确称取一定量的各类药品，溶于dH2O，氨基酸终浓度2.5mg·mL-1，维生素和核苷酸终浓度2.5ug·mL-1，用0.22um无菌滤膜过滤除菌，-20℃贮存备用。 3.3 生理盐水 NaCl 0.85g，蒸馏水100mL，高压灭菌01Mpa, 15min。 4. 实 验 步 骤 4.1 菌液制备 （1） 实验前14—16h，挑取少量K12SF+菌，接种于盛有4mL肉汤培养液的试管中，置37℃培养过夜。 （2） 第二天添加4mL新鲜的肉汤培养液，充分混匀后，分装成2只试管，继续培养5小时。 （3） 取4mL菌液倒入离心管中，离心(3,500rpm)10min。 （4） 倾去上清液，打匀沉淀。加入4mL生理盐水。 4.2 诱变处理 （1） 吸上述菌液4mL于培养皿内，将培养皿放在15W的紫外灯下。距离28.5cm。 （2） 处理前先开紫外灯稳定30min，将待处理的培养皿连盖放在灯下