第六章PCR技术.pptVIP

3.延伸时间和温度 延伸温度：一般选择在70～75℃之间,常用温度为72℃ 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定,1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min 延伸时间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些 4.平台效应 引起平台效应的因素： （1）dNTP或引物等消耗殆尽 （2）酶活性逐渐降低 （3）最终产物的阻化作用（焦磷酸盐、双链DNA） （4）非特异性产物或引物的二聚体与反应模板的竞争作用 （5）浓度在10-8mol/ L 时的特异引物的重退火（延伸率降低，TapDNA聚合酶消耗，产物链分叉，引物移位） 6.2.5 PCR反应特点 1.特异性强 2.灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(?g=10-6)水平 3.简便、快速 在DNA扩增仪中进行变性-退火-延伸反应，一般1～3 小时完成。 4.对模板的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。 6.3 PCR技术的应用 1 基因组中特异片段克隆 2 反向PCR 3 不对称PCR 4 RT-PCR 5 基因的体外诱变 6 基因组的比较研究 6.3.1 基因组中特异片段克隆 6.3.2 反向PCR与染色体步移 反向PCR(reverse PCR)：是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段 。 染色体步移：反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。 6.3.3不对称PCR与DNA序列测定 6.3.4逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR） 1.逆转录聚合酶链式反应：先用逆转录酶作用于mRNA，以寡聚dT为引物合成cDNA第一链，然后用已知一对引物，扩增嵌合分子，这种方法称为逆转录（reverse transcription,RT）PCR，即RT-PCR。 2. RT-PCR步骤 RNA样本的制备 逆转录反应 用于该反应的引物可以是随机六聚体核苷酸，也可以是oligo(dT)n。 PCR反应体系 6.3.5基因的体外诱变 它主要足利用寡核苷酸引物在碱基不完全互补配对的情况下亦能同模板DNA退火结合的能力，在设计引物时人为地造成碱基取代、缺失或插入，从而通过PCR反应将所需的突变引入靶DNA区段。然后将突变基因与野生型基因作功能比较分析，就可以确定所引入的突变的功能效应。 6.2.6基因组的比较研究 随机扩增多肽DNA分析（RAPD)：用随机引物扩增出来的PCR产物，经琼脂糖凝胶电泳之后所曾现的带型反映着用作扩增模板的DNA分子的总体结构特征。因此，用随机引物的PCR 扩增能够测定两个生物体（不论是两个不同的物种还是同一个物种的两个不同个体）基因组之间的差异。两个物种的个体之间，亲缘关系越近，其相应的PCR扩增带型也就越相似。（random amplified polymorphic DNA） PCR 可以把 指定的基因片段 数量放大 染色体 PCR 基因放大连琐反应 第六章 聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) 6.1发展简史 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了聚合酶链反应。 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高。 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶，Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。 1. 定义 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)：在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。 2.PCR技术的优点 特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等。 能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍。 6.2 PCR技术体系 6.2.1 PCR的基本原理 6.2.2聚合酶链式反应体系 6.2.3PCR引物的设计 6.2.1 PCR的基本原理 1. denaturatation 2. Primer annealing 3. Primer extension ①模板DNA变性： 模板DNA经93℃左右加热一定时间后，双链DNA模板或经PCR扩增形成的双链DNA解离成为单链。 ②模板DNA与引物的退火(复性)： 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 ③引物的延伸： DNA模板--