水稻条纹病毒基因功能的研究.pdfVIP

14 2009年海峡两岸植物病理学术研讨会 水稻条纹病毒基因功能研究 熊如意1～，吴建祥1，徐毅1，周益军1～，周雪平1 1浙江大学生物技术研究所，2江苏农业科学院植物保护研究所 水稻条纹病毒(Rice stripevirus，RSV)弓I起的水稻条纹叶枯病近年来在我国 广大水稻产区爆发流行，对水稻生产造成了严重损失。由于该病毒病是由介体灰 飞虱(Laodelphaxstriatellus)以循徊增殖型方式传播，并能经卵传毒，因此防治上 较为困难。为了弄清水稻条纹病毒的致病机理，对RSV的几个基因进行了原核 表达，并对NS3和NSvc4蛋白的功能开展了研究。 并制备了相应的抗体。斑点免疫杂交表明，4个抗体均能用于检测发病的水稻叶 片和带毒灰飞虱中的相应蛋白。 RNA沉默是一种植物体内固有的抗病毒防卫反应，在防御病毒侵染中起重 要作用。农杆菌共浸润转GFP基因本氏烟试验发现RSV编码的蛋白中只有NS3 能抑制GFP基因诱导的局部沉默，并且能抑制GFP的系统沉默和沉默信号的系 迹分析证实NS3和GFP共浸润本氏烟6天后局部GFPmRNA和GFP蛋白明显 增强。通过检测浸润部位siRNA的积累量发现NS3能够明显减少siRNA的积累。 对NS3进行一系列突变后发现NS3蛋白的5’端和3’端都是抑制沉默所必需的。 位已经全部发生沉默。表明NS3能够抑制dsGFP启动的RNA沉默。利用电泳 与ssRNA的结合能力随着蛋白浓度的增加而增强：NS3蛋白既能与单链siIⅢA 结合也能与双链siRNA结合，说明了NS3蛋白作为抑制子是通过结合siRNA而 NS3基因与钮P融合表达载体 阻止沉默复合体(RISC)的形成起作用的。以RSV 在洋葱表皮和烟草表皮细胞中对NS3蛋白的亚细胞定位进行了研究。用基因枪 法将NS3与GFP融合表达载体导入洋葱表皮细胞，在共聚焦显微镜下观察发现 NS3融合蛋白能在细胞质和细胞核中积累，在细胞核中积累量较高。利用农杆菌 浸润法将融合表达载体在本氏烟叶片表皮细胞中进行瞬时表达，激光共聚焦显微 15 2009年海峡两岸植物病理学术研讨会 镜观察发现NS3融合蛋白主要定位于烟草表皮细胞的细胞核内。而将预测的核 体无法定位于细胞核中，而是主要定位于细胞质中，暗示了所预测的NLS可能 是NS3蛋白的一个功能的核定位信号。用制备的NS3抗体对RSV侵染的水稻叶 片中的NS3蛋白进行亚细胞定位，电镜观察发现该蛋白在健康水稻中没有积累， 而在病毒侵染的水稻细胞核中表达并积累。用农杆菌介导的方法将35S启动子驱 动的NS3基因转化本氏烟、普通烟和水稻，PCR和No．hem印迹分析表明N站 基因己整合入这些转基因株系的基因组中，但没有发现植株生长发育出现任何异 常，说明RSVNS3沉默抑制子并不是致病因子。为了研究NS3结合siRNA的能 力与其基因沉默抑制功能之间的联系以及明确NS3结合siRNA的区域，我们将 NS3蛋白中保守位点的11个带正电荷氨基酸突变为甘氨酸等不带电荷的氨基 酸，构建到植物表达载体中分别在普通本氏烟和转基因本氏烟16c上进行抑制子 功能验证，结果发现NS3抑制子的活性与该蛋白结合siRNA能力密切相关，将 物体内NS3的沉默抑制功能也几乎完全消失。 利用基因枪将运动缺陷型PVX载体与构建的RSV编码基因表达载体共轰 击本氏烟叶片，GUS染色后发现只有NSvc4能够互补运动缺陷型PVX的运动功 能而在多个细胞间运动；以NSvc4与GFP的融合表达载体导入本氏烟表皮细胞， 激光共聚焦显微镜下观察发现融合蛋白能够在细胞间运动，表明NSvc4是RSV 编码的运动蛋白。通过基因枪轰击NSvc4与GFP的融合表达载体到洋葱表皮细 胞中发现融合蛋白定位在细胞核和细胞周质中。同时用农杆菌浸润的方法将融合 表达载体浸润本氏烟叶片，共聚焦显微镜下观察发现融合蛋白主要定位在细胞壁 上的胞间连丝。用胶体金标记定位发病水稻叶片和转NSvc4