骆健美综合.doc

5.1 基因工程制药: 在体外通过重组DNA技术，对生物的遗传物质基因进行剪切、拼接、重新组合，与适宜的载体连接，构成完整的基因表达系统，然后导入宿主生物细胞内，与原有遗传物质整合或以质粒形式单独在细胞中繁殖，并表达活性蛋白质、多肽或核酸等药物。 一、基因工程菌：微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表达外源基因或过量或抑制表达自身基因的工程生物体。有时也叫重组菌 二、基因工程菌构建后需要进行哪几方面的筛选？ 适宜宿主菌的筛选 工程菌的表达筛选常常以表达目标蛋白质的量及形式（SDS－PAGE电泳检查）为主要考察对象，结合表达载体的稳定性，对转化细胞进行筛选，获得遗传性稳定、高效表达的工程菌。基因工程菌生产一般是诱导性表达产物，要根据目标基因产物的表达模式而定。[1) 化学诱导表达 2) 温度诱导表达 ] 工程菌表达时的影响参数：接种量、诱导条件（诱导物浓度、诱导时间、发酵温度）、诱导前细胞生长时间、诱导后细胞密度、培养基组成及其添加物等。 工程菌的产物检测产物存在场所和存在形式的鉴定（表达部位： 胞外，周质，胞内； 存在形式：包涵体，可溶性蛋白）表达产物结构与活性鉴定 工程菌的遗传稳定性筛选哪一种更为常用，并简述原因 第二：大肠杆菌质粒又是最常用的质粒，因为大肠杆菌质粒上有诸如抗青霉素基因等易于检测的标记基因，并且容易使目的基因在宿主细胞中复制和表达。 第三：大肠杆菌是一种典型兼性厌氧细菌，由于体积小，表面积与体积的比例很大，并且能利用氧气进行彻底生物氧化释放大量能量，因而能够与外界迅速进行物质和能量交换，并在体内迅速转化。这样一来使大肠杆菌新陈代谢极其迅速，就如同一个效率极高的化工厂，而与真正化工厂相比所需反应条件又很温和，容易达到，其经济效益是显而易见的。 四、基因工程菌的构建流程：目标基因的获得、表达载体的构建、工程菌的构建 5.2 一、热敏性蛋白质的生产中采用怎样的培养策略?为什么? 对于热敏感的蛋白质，生产期可采用先高温诱导，然后降低温度，进行变温表达，避免蛋白质不稳定性降解。采用两段变温发酵培养： 前期：较高温度发酵，获得足够高的菌体密度；后期：较低温培养发酵，对菌体合成目标产物的抑制不明显，但可有效抑制目标产物的降解和包涵体形成，总体提高工程菌的生产能力。 二、温度诱导的大肠杆菌表达系统 对于温度诱导的大肠杆菌表达系统，生长期采用最适菌体生长的37℃，而进入生产期，则需要提高温度，一般为42℃，启动外源基因转录、翻译等过程，实现产物的最大限度表达。 三、对于采用温敏启动子控制的质粒，大肠杆菌由30℃升高到42℃诱导外源基因表达目的产物时常常伴随质粒的丢失，怎么解决？ 对于大多数基因工程菌，在一定温度范围内，随着温度的升高，质粒的稳定性下降。大肠杆菌在30℃左右质粒稳定性最高。 建立基于温度变化的分布连续培养，在第一个反应器中，30℃下进行生长培养，增加质粒的稳定性，然后流入第二个反应器中，在42℃下进行诱导产物表达。 四、简述基因工程菌遗传不稳定性的具体表现形式？其中，质粒不稳定性主要由什么原因引起？ 1DNA片段缺失； 2）染色体DNA的不稳定性：整合到染色体的外源DNA 在分裂期间发生重组、丢失或表达的沉默； 3）表达产物的不稳定性。 原因：质粒复制不稳定性、质粒分配不稳定性、质粒结构不稳定性 、培养条件引起的质粒不稳定性 五、工程菌与宿主菌对培养基组成最大的不同是什么，为什么？ 选择剂：发酵培养过程中质粒容易丢失，使之成为宿主菌。为了保证质粒的稳定性，不丢失。根据质粒上的 选择标记有两类，抗生素抗性选择标记 营养缺陷互补标记 诱导物：诱导表达型的基因工程菌，在细胞生长到一定阶段，必需添加诱导物(inducer)，以解除目标基因的抑制状态，活化基因，进行转录和翻译，生成产物。 5.3 描述细胞群体生长的4种模型 微生物发酵过程特征：前、中、后期 1）延滞期:是指接种后，菌体的生物量没有明显增加的一段时间。是菌体适应环境的过程。 2）对数生长期 : 特点：生长速率达到最大值，并保持不变。细胞的化学组成与生理学性质稳定。菌体生长不受限制，细胞分裂繁殖和代谢极其旺盛。 3）减速期: 菌体生长速率下降的一段时间 4）静止期: 特点：①细胞数达到最大值，②生长速率与死亡速率处于一种动态平衡，③细胞内开始积累产物，④大多数芽孢菌形成芽孢， ⑤次级代谢产物在此阶段合成。 简述描述基质浓度对微生物生长动力学影响的模型、 该模型的假设条件和参数的物理意义。Monod提出典型均衡生长模型解释基质浓度对菌体生长的影响，该模型基于的假设有三点： ① 细胞均衡生长，只有细胞浓度是变化的； ② 只有一种基质限制细胞生长，即限制性基质，其他基质过量，但不影响细胞生长； ③ 细胞活动是一个单一反应，产量系数恒定。