细胞生物学实验教学指导书 .docVIP

有丝分裂实验 一、实验目的 学习植物根尖压片方法的基本技术。熟悉细胞有丝分裂各个时期的形态特征及染色体的变化，并学会染色体简易永久片的制片技术。 二、实验原理 有丝分裂是体细胞分裂的主要方式，一般发生在植物根尖或茎尖的分生组织中。在有丝分裂时，细胞核与细胞质有很大的变化，但以细胞核内染色体的变化最为明显，而且是有规律地进行。各种生物染色体在数目上和形态上是相对恒定的，并随科属种的不同而具有一定的特征。洋葱体细胞中有8对共16条染色体，在有丝分裂过程中，每个染色体能复制一份，然后分配到两个子细胞中，所以两个子细胞与母细胞所含的染色体在数目、形态和性质上都是相同的。在细胞遗传学研究中，人们常常需要了解某一物种的染色体数目，而最有效的方法就是观察细胞有丝分裂的中期，这样能得到较为准确的结果。 三、实验材料 洋葱（Aillum cepa）根尖 蚕豆（Vicia faba）根尖 四、实验器具和药品试剂 显微镜、培养箱、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、载玻片、盖玻片、烧杯、量筒、滴瓶、切片架、切片盒、凹面玻片、青霉素瓶、大培养皿、纱布、吸水纸、铅笔、吸管。 卡诺氏固定液（甲醇或95%乙醇3份，冰醋酸1份）、改良苯酚品红染色液（见附录：实验试剂的配制）、0.002M8-羟基喹啉水溶液、0.05—0.2%秋水仙素溶液、对二氯苯饱和水溶液、1N HCl、95%乙醇、正丁醇、加拿大树胶。 五、实验方法和步骤 （一）材料准备 选取蚕豆（或小麦、玉米等）种子放在烧杯中，放清水浸泡过夜，使种子吸水胀大后倒出，再用清水洗几次，用多层纱布包好种子，放进20～25℃培养箱内培养。当根尖长1～3cm 时，即可以进行预处理。 （二）预处理 为了有利于对有丝分裂中染色体的观察和计数，在固定之前应用理化因素进行预处理，这样可以改变细胞质的粘度，抑制或破坏纺锤丝的形成，促使染色体缩短和分散等。一般是在分裂高峰前处理1.5小时以上。处理的方法如下： 1．秋水仙素水溶液 常用浓度为0.05～0.2%，室温下处理2～4小时。对抑制纺锤体活动的效果明显，易于获得较多的中期分裂相，并且染色体收缩较直，有利于对染色体结构的研究。 2．对二氯苯饱和水溶液 室温下处理3～5小时，对阻止纺锤体活动和缩短染色体效果也较好，对染色体小而多的植物中，计数染色体制片效果最好。 3．8-羟基喹啉水溶液 使用浓度为0.002—0.004M，一般认为它将引起细胞粘滞度的改变，进而导致纺锤体活动受阻。通常处理2～4小时，可使中期染色体在赤道面上保持其相应的排列位置，另一优点是处理后的缢痕区较为清晰。 4．低温处理 将材料如小麦，浸入蒸馏水内，放置到1～4℃冰箱中（玉米及水稻6～8 下表为不同材料采用不同预处理方法获得的效果，供参考。 植物名称 染色体数(2n） 处 理 因 素 处理时间 温 度 效 果* 小麦 42 0.2%秋水仙素水溶液 9:00-11:00 25 +++ 小麦 42 对二氯苯饱和水溶液 10:00-14:00 室温 +++ 小麦 42 1～4℃ 20-24小时 1～4 +++ 小黑麦 56 对二氯苯饱和水溶液 10:00-14:00 室温 +++ 豌豆 14 对二氯苯饱和水溶液 10:00-11:30 室温 +++ 烟草 48 对二氯苯饱和水溶液 8:30-11:30 室温 +++ 蚕豆 12 0.05～0.1%秋水仙素水溶液 20:00-23:00 室温 +++ 蚕豆 12 0.05～0.1%秋水仙素水溶液 14:30-17:30 8 +++ 洋葱 16 0.05～0.1%秋水仙素水溶液 7:30-11:30 15 +++ 茄子 24 0.002M 8-羟基喹啉 9:00-13:00 15 +++ 大麦 14 0.05～0.1%秋水仙素水溶液 8:00-11:00 25 ++ * +++优 ++良。 （三）固定 通常采用的是卡诺氏固定液。固定的目的是用化学的方法把细胞迅速杀死，使蛋白质变性，并尽量保持原来的分裂状态，同时更易于着色。固定时，将根尖投入固定液中室温处理3～24小时。材料若不及时用，可经过90%酒精和70%酒精浸洗一次，再换入新的70%酒精中，置于冰箱内0～4℃保存备用。经过较长时间保存的材料，在进行观察前可用固定液再处理一次，效果较好。 （四）解离 目的是使分生组织细胞之间的果胶质层解掉，并使细胞壁软化，便于压片。解离的时间视根尖的粗细老嫩不同而有差异。方法是：将固