高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatograph）课件.pptVIP

高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatograph） 一.工作原理 储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进 入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相) 内，由于样品溶液中 的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时， 经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产 生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器 时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打 印出来。 二.特点 1.速度快：通常分析一个样品在15～30 min，有些样品甚至 在5 min内即可完成。 2.分辨率高：可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 3.灵敏度高：紫外检测器可达纳克级，荧光和电化学检测器 可达皮克级。 4.色谱柱可反复使用：用一根色谱柱可分离不同的化合物。 5.样品量少，容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以 收集单一组分或做制备。 三.仪器组成 ·储液器 ·输液泵 ·进样器 ·色谱柱 ·检测器 ·操作软件 1.储液器 盛放流动相，材质一般为玻璃，也有不锈钢或特种塑料材质，容积大小 不等，以500-2000ml比较常见。 3.3 自动进样器 四.UPLC（UHPLC） 五.配置 * 2.输液泵 2.1 基本要求：提供5-50Mpa的柱前液压；输出无脉动恒定的液流；流速范围0.1-10ml/min；流量精密度RSD 0.5%或更好；系统组件耐腐蚀，耐高压，没有爆炸危险。 2.2 组成模式 （1）等度模式 输液泵输出的液体流速不变。 （2）梯度模式 输液泵输出的液体流速随时间改变，又分为低压梯度 和高压梯度。低压梯度用一个输液泵加一个电磁阀 （比例阀）即可实现，成本较低，流动相混合比例误差 相对大；高压梯度每一路流动相都需要一个单独的输 液泵，成本较高，流动相混合比例更准确。 3.进样器 3.1 手动进样器 Rheodyne 7725i型 世界各大色谱制造商均选用此品牌，进样次数 可达30000次 3.2 手动进样针 针头为平头，容积以10或20ul最常见 品牌：瑞士hamilton，国产上海高鸽等 全自动进样，提高进样过程的稳定性，降低劳动强度，可满足几十个甚至上百个样品的进样需求。有些自动进样器带有控温功能，适合热敏性样品。 4.色谱柱 4.1 分类： 反相色谱柱：C18色谱柱，C8色谱柱，C4色谱柱等，固定相极性小于流 动相，流动相成分包括水，甲醇，乙腈等。 正相色谱柱：氨基柱，氰基柱，硅胶柱等，固定相极性大于流动相，流 动相成分包括苯，己烷，庚烷等。 4.2 品牌：安捷伦，沃特斯，Merck，岛津，GL Sciences，资生堂， 菲罗门，依利特，迪马等 5.检测器 5.1 紫外吸收检测器（UVD）：是目前HPLC中应用最广泛的检测器。它的主要特点是灵敏度高（10-9g），线性范围宽（105），对流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱。它要求被检测样品组分有紫外吸收，属于选择性检测器。 5.2 二极管阵列检测器（PDAD）：是20世纪80年代才出现的一种光学多通道检测器，它可以看作是UVD的一个分支。在对每个洗脱组分进行光谱扫描，经计算机处理后，得到光谱和色谱结合的三维图谱。其中吸收光谱用于定性（确证是否是单一纯物质），色谱用于定量，常用于复杂样品（如生物样品、中草药）的定性定量分析。 5.3 荧光检测器（FLD）：同样属于选择性检测器，其灵敏度在目前常用的HPLC检测器中是最高的，应用也较多，仅次于UVD。它适用于能激发荧光的化合物。很多与生命科学有关的物质，如氨基酸、胺类、维生素、甾族化合物及某些代谢药物都可以用荧光法检测。荧光检测器在生物样品