基于序列特异扩增区域标记的栗疫菌巢式PCR检测技术.pdfVIP

浙江夫学学报 (农业与生命科学版) 41(1)：25～33，2015 JournalofZhejiangUniversity(Agric． LifeSci．、 http：／／www．journals．zju．edu．cn／agr E—mail：zdxbnsb@zju．edu．cn DOI：10．3785／j．issn．1008—9209．2014．06．261 基于序列特异扩增 区域标记的栗疫茵巢式 PCR检测技术 麻文建，郑磊 ，张静，刘洋，朱天辉 (四川农业大学林学院，四川 雅安 625014) 摘要 为建立栗疫菌(Cryphonectriaparasitica)快速 、准确的检测技术，利用随机扩增 多态性 DNA技术 (random amplifiedpolymorphicDNA，RAPD)对不 同来源地的栗疫菌和其他真菌分 离物进行 PCR扩增 ，筛选 出栗疫菌的 RAPD特异 片段 SCQ494．将特异 RAPD片段 SCQ494进行 分离、回收，与载体 pMD~l9一T载体连接 ，转化 至大肠 埃希茵进行培养，对 目标片段克隆测序．根据测序结果，用Primer5．0软件设计 了序列特异扩增 区域 (sequence characterizedamplifiedregion，SCAR)引物 CQ1／CQ2和 巢式 PCR 引物 CR1／CR2．利 用引物 CQ1／CQ2通过 常规 PCR对不 同来源地供试栗疫茵可扩增 出1条约1420bp的条带 ，对其他供试菌株 DNA 的 PCR产物均无此条带， 检测灵敏度为 3pg／#L的基 因组 DNA；而 以引物 CQ1／CQ2为外 圈引物和 引物 CR1／CR2为 内圈引物进行 的巢式 PCR可从栗疫茵基因组 DNA 中扩增 出1条大小约 875bp的条带，灵敏度达到 3Ofg／L，是常规 PCR的 i000倍 ． 验证实验表明巢式 PCR可以从发病程度不 同的粟树枝干和在 自然感染的栗树枝条 中检测 出栗疫菌． 关键词 栗疫菌 ；随机扩增多态性 DNA技术 ；序列特异扩增 区域 ；巢式 PCR；分子检测 中图分类号 Q939．95；S432．44 文献标志码 A Developmentofnested-PCR fordetection ofCryphonectria parasitica based on themarkerofsequence characterizedamplifide region．JournalofZhejiangUniversity(Agric．8LLifeSci．)，2015，41(1)：25—33 MaWenjian，Zheng Iei，ZhangJing，LiuYang，ZhuTianhui (Collegeof Forestry，SichuanAgricultural University，Yaan625014，Sichuan，China) Summary Chestnutblight，causedbyCryphonectriaparasitica，isadestructivediseaseonchestnuttreesaswell asan importantinternationaldiseaseintheworld．Attheendofthe19th centuryandthebeginningofthe20th century，thispathogendispersedrapidlyandnearlykilledalltheAmericanchestnuttrees．Cryphonectriaparasitica belongstoascomycetes，whichmainlycausedconsiderabledamagetospeciesofgenusCastanea，suchasC．sativa， C．henryi，C．dentata，andsoon．In recentyears，thechestnutblighttendsto beaggravated and hascaused tremendous l