番荔枝二萜类化合物抑制肝癌增殖及其机制的研究.pdf

番荔枝_二萜类化台物抗肝擒增殖及其机制研究 中文摘要 研究背景 肝细胞癌是最常址的人类致死性恶性肿瘤之一，对人类健康危害极大。我国是原发性肝 癌的高发国家之一．死亡率在消化系统恶性肿瘤中列第三位，仅次于胃癌雨『食道癌，但目前 肝癌的中、晚期治疗，尚无有效的方法，中医药作为综合治疗的重要组成部分，有一定的疗 效和独特的优势，成为肝癌治疗的重要手段之一，而发挥中医药的优势，_l=|』分子生物学方法 研究中医药防治肝癌，提高肝癌的治疗效果．一真是我国肝癌研究的重要课题。近年来，中 药有效成分利提取物抗肿瘤的研究一直是国内研究的热点，目前，国内外在番荔枝抗肿瘤的 研究方面取得了一定的进展，以章永红教授为首的科研组初步的动物体内抗肿瘤实验结果表 明，番荔枝提取物对小鼠移植性肉瘤S180有明显的抗肿瘤活性，以50mg／kg×7d剂量灌胃 给约，其抑瘤率可达41％。同时研究了圆滑番荔枝中其中～个二萜类化合物对人肝癌细胞株 因的表达，增加bax基因的表达。本研究旨在为从番荔枝中寻找新的有效治疗肝癌的鲥物提 供理论依据。 研究目的 本课题将从f|{=荔枝中提出的5种一萜类化合物中筛选出抗癌活性强的单体成份，并从体 外秆1体内两个方面评价其抗肝癌作用，在分子生物学水平初步阐明其抗月1-瘤机制。为研制。 种新型抗肿瘤药物奠定基础，同时为临床运刚蒲荔彼进行抗癌治疗提供客观依据和一定的理 论支持。 研究方法 体外实验： 1．活性蒲荔枝二萜类化合物单体的筛选 ， 采用MTT法，观察5种乔荔枝二萜类化台物单体对体外培养人肝癌细胞株HepG2 SMMC7721的抑制作}：|』，井考察其量效神『时效关系。筛选山对HepG2抑制作埘强的单体。 2．活性侨荔枝一：萜类化合物单体抗肿瘤作用机理探讨 究 A，倒置相差显微镜观察细胞形态的变化。 C．透视电子显微镜(TEId)观察细胞超微结构的变化，以观察是否出现细胞出芽，凋亡 小体，胞浆内空泡和核染色质固缩，碎裂，边集等现象和线粒体嵴的变化。 D．琼脂糖凝胶电泳分析肿瘤细胞内生化指标的变化，看是否有DNAladdcr出现。 E．流式细胞术观察有无sub—G1峰出现，检测细胞凋亡率．并进行细胞周期分析。 从以上五种方法来确定活性需荔枝二萜类化合物单体是否以通过诱导细胞凋亡方式来 抑制肿瘤细胞增殖。 (2)活性舔荔枝二二萜类化合物单体体外诱导人肝癌细胞株HepG2凋亡机制的研究 A．激光共聚焦技术(LSM)检测活性需荔枝二萜类化合物对细胞膜电位(MP)、线粒俸电 位(△埘m)以及细胞内Ca2+浓度的影响。 B．基因微矩阵技术检测活性需荔枝二萜类化合物对肿瘤细胞内与凋亡相关基因的变化 C．采崩Western b]ot羽1检测与凋亡相关的基因Bax、Bcl．2、Caspase．3的变化， 体内实验： 1．观察活性番荔枝二萜类化合物单体的抑瘤作用及副作用 南京中氍药大学博士学链论文 莱．I{j移植性肝癌小鼠模型(HepS)，观察活性瓣荔枝二萜类化含物单体的抑瘸忭用，以 及对小鼠血常规、生化指标的影响。 2．露察活性番荔校二萜类位台物攀体对移植健脬癌小鼠模型(Heps)免疫嚣留脾、腌繇 及K辍缓麓麓影魂。 3．免疫组化法观察活性番荔枝二萜类纯合物单体对移植性孵瘸小鼠模型(HepS)体内与 凋亡的撼因Bax、Bcl。2、VEGF表选的影响。 研究结果 呈明鼗抑制作嗣，且濑药物浓度的掇商和作用时间的延长而增强，其中，L2—26作用强于 制浓度(IC50)分别为47．2uM／L、53．33uM／L，。L2—1l最高抑制率分别为77．73％和69．55％。 IC50分别为71．38uM／L、84。72uM／L。 2．L2—26终翊入孽子癌绍胞ttepG2螽，在荧光鼗微镜、透射电镜、扫搐电镜下蕊察§l缅 胞凋亡的特征形态改变，如细胞体积缩小，胞膜皱缩，表面微绒毛潲失，核固缩、沿核膜分 耀等，流式细胞仪定黛分析在DNA崴方图上各浓度蛆均见有孤二倍体峰的出现。L2．26作 用24h厢。出现ladder带。 荧光驻微镜观察，亦如现部分细德骥暇缩，核变小，染色质浓集，等典溅的凋亡特征，邂射电镜 观察出域新月型核、捌亡小