miR_21真核表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖与凋亡的影响.pdfVIP

·6 · 中国癌症防治杂志2013 年3 月第5 卷第1 期 Chin J of Oncol Prev and Treat ，Mar 2013 ，Vol. 5 ，No. 1 基础研究 miR-21 真核表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖与凋亡的影响 △ 孙阳阳 丁 骏 周晓丽 朱逸之 △ 作者单位：213003 常州 南京医科大学附属常州市第二人民医院病理科；南京医科大学附属常州市第二人民医院 肿瘤中心实验室 【摘要】目的 探讨人微小RNA-21 （miR-21）重组表达质粒对人胃癌SGC-7901 细胞增殖与凋亡的影响及可能机制。方法 设计合成靶向miR-21 的互补双链DNA，退火后与真核表达载体pPG-miR-EGFP 克隆连接，构建pPG-miR-21-EGFP 重组 表达质粒，利用脂质体LipofectamineTM2000 将鉴定正确的重组表达质粒pPG-miR-21-EGFP 转染人胃癌SGC-7901 细胞， 荧光显微镜下观察转染效率。实验分为3 组：空白对照组、空载体组、重组表达质粒组。以RT-PCR 检测转染前后胃癌细 胞miR-21 的表达水平。MTT 法评价重组表达质粒抑制肿瘤细胞生长的效果，流式细胞术及Hoechst 33258 法检测转染后 胃癌SGC-7901 细胞周期的分布和凋亡。Western blot 法、免疫细胞化学法分别检测转染前后PTEN、PCNA、PDCD4、bcl-2、 cyclin D1 蛋白表达的水平。结果 酶切及测序鉴定证实成功构建重组质粒pPG-miR-21-EGFP ，转染人胃癌SGC-7901 细 胞后，荧光显微镜下观察转染效率达75% 。RT-PCR 检测显示重组表达质粒组胃癌细胞miR-21 的表达下调，与空白对照 组和空载体组比较，差异具有统计学意义（P0.05）。Western blot 法、免疫细胞化学法检测结果显示重组表达质粒组胃癌 细胞cyclin D1、PCNA、bcl-2 蛋白的表达下调（P0.05），而PDCD4、PTEN 蛋白的表达上调（P0.05）。重组表达质粒组的细 胞生长缓慢，凋亡指数增加。流式细胞术检测结果显示重组表达质粒组G1 期细胞的百分比较空白对照组增加［（69.71± 0.314）% vs （50.1±0.331）%］，S 期细胞较空白对照组明显减少［（14.68±0.448）% vs （28.47±0.316）%］（P0.05）。结论 重 组表达质粒pPG-miR-21-EGFP 可显著下调miR-21 在胃癌SGC-7901 细胞中的表达，并在一定程度上抑制胃癌细胞的增 殖，促进其凋亡，使较多的细胞停留在G1 期，S 期细胞减少，其作用机制可能是通过下调cyclin D1、PCNA、bcl-2 蛋白的 表达，上调PDCD4、PTEN 蛋白的表达而实现的。 【关键词】胃肿瘤；微小RAN-21 ；增殖；凋亡 【中图分类号】R735.2 【文献标识码】A 【文章编号】1674-5671 （2013）01-06 DOI ：10.3969/j.issn.1674-5671.2013.01.02 Construction of a recombinant eukaryotic expression vector of miR-21 and its effects on proliferation and apoptosis in gastric cancer cells SUN Yang-yang ，DING Jun△，ZHOU Xiao-li ，ZHU Yi-zhi （Department of Pathology ，The Second People ′s Hospital of Changzho