CalceinAM和Annexin+V在流式细胞术检测早期细胞凋亡的敏感性比较.pdfVIP

182 JoumalofClinical 临床检验杂志2006年第24卷第3期ChineseLaboratory 中图分类号：R329．2 文献标识码：A ·实验研究· 文章编号：1001-764X(2006)03-0182-03 Calcein—AM和AnnexinV在流式细胞术检测早期细胞 凋亡的敏感性比较宰 王佳，冯永东，陶德定，李小兰，肖薇，刘双又，余从年，龚建平(华中科技大学同济医学院分子医学中心，武汉430030) 比较Calcein．AM与Annexin 摘要：目的 V用于流式细胞术检测活细胞早期凋亡时的敏感性，建立新的检测细胞早期凋亡的 硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V(AnnexinV)染色，然后用流式细胞仪分析凋亡率，通过比较诱导后不同时间点的凋亡率来分 析Calcein．AM和AnnexinV对于检测细胞早期凋亡的敏感性。结果在喜树碱诱导模型中，加药后2 测到明显的细胞凋亡，而3h后才能用AnnexinV检测到；在紫外线诱导模型中，照射后l V更为敏感，是一 细胞凋亡，而要在2h后才能用AnnexinV检测到。结论Calcein—AM用于检测活细胞早期凋亡比Annexin 种稳定、可靠、灵敏度高并且较为经济的检测细胞早期凋亡的活细胞染料。 关键词：流式细胞术；凋亡；线粒体膜通透性；Calcein—AM；膜联蛋白V 细胞早期凋亡时线粒体会发生一系列的变化， 仙∥ml链霉素和2 其中线粒体膜屏障功能的丧失是各类细胞发生凋亡 培养液中，于37oC、5％CO：培养箱中培养至对数 的共同的、不可逆性环节。Calcein—AM是一种脂溶 105／m1]。 生长期[密度约为(3～5)X 性物质，本身无荧光，可自由通过胞膜进入细胞质和 细胞器包括线粒体基质内。进入后Calcein—AM可 000 胞均分为两份于无菌离心管中，1 r／min离心弃 被胞内酯酶水解产生水溶性的Calcein(钙黄绿素)， 培养基后换为等量的Hanks液(不含酚红和碳酸氢 am 存留于胞质以及线粒体基质中。Calcein在494 钠，另外加人1mmoL／L 7．3)，其中一组 HEPES，pH 激发光下可产生绿色荧光，这种荧光在C02+存在时 加入1 CoCl2，另一 ixmol／LCalcein．AM和1肛moL／L 猝灭。已知线粒体内膜是细胞内唯一不能通过 组不加荧光染料，两组均置于37℃温箱中温育15 C02+的膜性结构，所以，正常细胞加入Calcein-AM 000 min，取出后1 和CoCl：后，线粒体内仍呈现Calcein的绿色荧光， 用流式细胞仪可测到其信号。如细胞经诱导发生凋 通1640培养基，随后进行凋亡诱导。 亡，线粒体内膜通透性变大，c02+进入线粒体内， Calcein的