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PEDF 对脑胶质瘤凋亡的影响1 张弢，关明，吕元 复旦大学附属华山医院检验医学中心，上海（200040 ） E-mail ：yuanlu@ 摘 要：目的 评价色素上皮细胞衍生因子（PEDF ）对胶质瘤凋亡作用的影响。方法 TUNEL 法检测胶质瘤细胞凋亡；western-blot 检测凋亡相关蛋白 p16 的变化。结果 实验数据显示：与 对照组相比，PEDF 处理过的凋亡细胞产生明显增多，凋亡率达41.5% （P 0.01 ）；随着PEDF 表达的增加，抑癌基因p16 的表达明显增高。结论 PEDF 与p16 协同作用，通过诱导胶质瘤 细胞凋亡，从而抑制胶质瘤增殖和侵袭。 关键词：色素上皮细胞衍生因子，胶质瘤，凋亡 色素上皮细胞衍生因子（PEDF ）是一种具有多种生物学活性的蛋白质，由RPE细胞分泌至 视网膜光感受器基质中，玻璃体和房水中浓度也较高。多年的研究表明：PEDF是一种神经营养 因子，具有促神经元生存，抗神经细胞凋亡，保护神经元免受神经毒性侵害及胶质细胞静息特 性[1] 。而近年来的研究发现：PEDF又是一种内源性的高效的新生血管抑制剂，直接作用于形成 新生血管的内皮细胞，通过抑制内皮细胞有丝分裂，诱导内皮细胞凋亡来抑制新生血管形成[2] 。 脑胶质瘤呈快速增殖和侵袭性生长等生物学行为是胶质瘤迄今为止对各种治疗难以奏效 的主要原因[3] 。脑胶质瘤在其快速增殖过程中涉及到多个步骤。肿瘤细胞通过细胞膜表面受体 粘附到细胞外基质(extracelluiar matrix, ECM) 层粘连蛋白上，局部基质被瘤细胞分泌的蛋白酶 所分解，水解酶对ECM主要是IV型胶原的水解瘤细胞，向被蛋白酶降解的基质区域运动通过基 [4] 底膜而迁移 。 我们在先前的研究中观察到：PEDF有效的抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭的现象。然而对 PEDF作用的机理仍然不清楚。本研究通过TUNEL法检测胶质瘤细胞是否发生凋亡；PEDF对胶 质瘤凋亡相关蛋白p16 的影响，进一步明确PEDF抑制胶质瘤增殖和侵袭的分子调控机制，从而 为抗胶质瘤侵袭和转移的治疗提供科学的理论依据。 1. 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 细胞：脑胶质瘤细胞 A172 由中科院细胞所提供。 1.1.2 试剂：RPMI1640培养基、青霉素（GIBCO试剂公司）；TUNEL试剂盒（RD公司）；兔 抗人P16多克隆抗体（DAKO公司）。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 A172 胶质瘤细胞培养于含 10%灭活血清的 RPMI 1640 培养基（青霉素 100 U/L，链霉素 100 mg/L）中，置于37℃、5% CO2 培养箱培养至对数生长期，第 N+2~N+4 代细胞用于实验中。 1本课题得到教育部博士点基金资助项目（20030246060 ）、上海市青年科技启明星计划资助项目（04QMX1408 ） 和上海市临床医学重点建设学科项目的资助。 1.2.2 TUNEL 法 取对数生长期的A 4 172细胞5×10 细胞爬片。试验组加入PEDF(A172PEDF) ，对照组加入相 同体积的PBS(A172con)作为对照。所有标本均应用4%多聚甲醛固定20 min ，用TdT酶将生物素标 记的dUTP连接到DNA断裂的3’OH端。加入ABC反应剂作用数分钟，再加入DAB/H O 溶液显色。 2 2 在计算机图像分析仪上，在200倍视野下每张切片拍摄5个阳性视