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小鼠肝Kupffer细胞分离方法探讨 　　作者：严茂林， 王耀东， 田毅峰， 赖智德， 周松强， 邱福南 作者单位：福建省立医院 肝胆外科,福州 350001 　　【摘要】目的 探讨分离BALB/c小鼠肝Kupffer细胞(KC)的方法。 方法 采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度离心、选择性贴壁三步法分离KC，并比较链霉蛋白酶、Ⅳ型胶原酶及联用链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶等3种不同酶消化分离方法所得KC得率及纯度。 结果 3种不同酶消化分离方法细胞得率分别为(6.32±0.5)×106 g-1，(3.66±0.4)×106g-1，(10.3±0.7)×106 g-1;细胞纯度分别为(93.2±1.7)%，(90.7±1.5)%，(94.5±1.9)%。 结论 联合链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶在体灌注和离体消化是分离小鼠KC的较好方法。 　　【关键词】 肝; 枯否细胞; 离心法,梯密度; 小鼠，近交BABLc ; 细胞分离 　　肝Kupffer细胞(Kupffer cell,KC)为定居在肝窦内的巨噬细胞，约占全身单核巨噬细胞总数的80%～90%。肝KC能吞噬、杀灭病原微生物，清除体内的内毒素，并具有抗原递呈、分泌细胞因子等免疫调节作用，同时影响肝细胞、贮脂细胞及内皮细胞的生物学功能[1]。近期发现KC能诱导同种异体T淋巴细胞凋亡，在调节肝移植免疫耐受中发挥重要作用[2]。如何获得较多数量和较高纯度的KC是研究其在机体中作用机制的首要条件。而传统的分离方法往往因数量和纯度不足而影响实验结果。本试验采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度、选择性贴壁三步法分离KC，探讨分离小鼠肝KC的较好方法。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1实验动物 BABL/c小鼠，雄性，10～12周龄，清洁级，由四川大学华西医学中心试验动物中心提供(许可证号：046)。试验前禁食12 h，自由饮水，随机分为3组。 　　1.1.2 主要试剂和仪器 Ⅳ型胶原蛋白酶、DNAaseⅠ、Percoll及HEPES(美国Sigma公司);兔抗人溶菌酶(lysozyme，美国DAKO公司);链霉蛋白酶E(瑞士Roche公司);RPMI1640培养基(美国Gibco公司)。超净工作台(苏州净化设备厂)，倒置显微镜(日本Nikon公司)，低温高速离心机(美国Beckman公司)。 　　1.1.3 主要液体的配制 (1)前灌注液(Hanks平衡盐溶液)。KCl 5 mmol/L,KH2PO4 1 mmol/L,NaCl 115 mmol/L,HEPES 25 mmol/L。调整pH值为7.4。(2)后灌注液及酶消化液配制。后灌注液、酶消化液均由hanks平衡盐溶液配制。方法1中的后灌注液含0.20%链霉蛋白酶2 mL;酶消化液：含0.20%链霉蛋白酶2 mL、0.012%DNAaseⅠ2 mL;方法2中的后灌注液含0.025%Ⅳ型胶原酶2mL。酶消化液：含0.05%IV型胶原酶2 mL;方法3中的后灌注液含0.05%Ⅳ型胶原酶1 mL、0.4%链霉蛋白酶1 mL;酶消化液：含0.10%Ⅳ型胶原酶1 mL、0.40%链霉蛋白酶1 mL、0.012%DNAaseⅠ2 mL; 　　1.1.4 SPS液的配制 100%Percoll液和8.5%NS以9∶1的比例混合，配制成SPS原液;以70%Percoll液2 mL配制：SPS 1.4 mL和PBS 0.6 mL混合配制所得;30%Percoll液的配制：PBS 1.4 mL和SPS 0.6 mL混合配制所得。 　　1.1.5 RPMI1640完全培养基的配制 按说明书配制，0.22 Μm滤器过滤除菌，临用前加入10%新鲜灭活的小牛血清，青霉素100 U/mL,链霉素100 Μg/mL。 　　1.2 BABL/c小鼠KC分离方法 　　1.2.1 原位肝脏灌注步骤参考文献[3]。 　　1.2.2 肝脏非实质细胞的提取及离心 将上述肝细胞滤液4 ℃离心(800 r/min×8 min)，取沉淀。加入PBS 4 mL，4 ℃离心(80 r/min×3 min)，除去沉淀，取上清。加入PBS 4 mL充分混匀，再次以4 ℃离心(150 r/min× 8 min)，取沉淀。沉淀加入PBS 2 mL,充分混匀。取10 mL离心管1支，依次加入70%Percoll、30%Percoll、细胞悬液各2 mL及少许PBS，4 ℃离心(1 600 r/min×22 min)。离心管自上而下依次为：细胞碎片、30%Percoll层、30%Percoll层与70%Percoll层之间的是大量KC及少量肝窦内皮细胞、70%Percol