香烯对人肺腺癌SPCA1细胞VEGFC及VEGFR3表达的影响.docVIP

香烯对人肺腺癌SPC-A-1细胞VEGF-C及VEGFR-3表达的影响 　　作者：周昆 崔黎 闫焱 刘红 赵松 陈奎生 作者单位：郑州大学第一附属医院胸外科，河南 郑州 450052 　　【摘要】目的 探讨榄香烯对体外培养的人肺腺癌SPC-A-1细胞株血管内皮生长因子(VEGF-C)及其受体VEGFR-3表达水平的影响。方法 采用免疫细胞化学方法对药物作用后的SPC-A-1细胞VEGF-C、VEGFR-3的表达水平进行检测。结果 榄香烯能明显抑制肺腺癌SPC-A-1细胞的生长并降低VEGF-C、VEGFR-3的表达水平，而且有时间和浓度依赖性。结论 榄香烯通过降低肺腺癌细胞VEGF-C、VEGFR-3的表达水平，从而遏制了肿瘤血管、淋巴管转移。 　　【关键词】 榄香烯; 肺癌细胞株;血管内皮生长因子; 免疫细胞化学 　　榄香烯(Elemene)是从中药温莪术(Gurcurma Wenyujin Y.HCHEN)的挥发油中提取的抗癌活性成分〔1〕，经红外、核磁共振和质谱鉴定证实有效成分为Β-榄香烯(Β-elemene)〔2〕,该药毒副作用小，无骨髓抑制作用，具有广泛的临床应用前景〔3，4〕。本实验采用细胞化学方法检测体外培养人肺腺癌SPC-A-1细胞株在不同浓度榄香烯作用下表达血管内皮生长因子(VEGF-C)及其受体VEGFR-3的水平，旨在探讨榄香烯在分子水平的抗癌机制，为临床应用提供理论基础和实验依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料和主要试剂 榄香烯乳注射液(大连金港制药公司);人肺腺癌SPC-A-1细胞株由上海中国生命科学院细胞库提供;改良型 RPMI 1640细胞培养基(含双抗)〔海克隆生物化学制品(北京)有限公司〕;胎牛血清(天津海林生物技术有限公司);胰蛋白酶(吉诺生物制品公司);VEGF-C、VEGFR-3单克隆抗体(工作浓度1∶100)(北京中杉金桥生物制品公司);免疫细胞化学ABC检测试剂盒(福州迈新公司);DAB显色试剂盒(北京中山生物技术公司)。 　　1.2 主要仪器 Olympus BH-2型双目显微镜(日本Olympus公司)，电热手提式压力蒸汽灭菌器(上海医用核子仪器厂)，CO2培养箱(NAPCO 产品，Model 5410)，超净工作台(上海净化设备厂)。25 cm2、75 cm2培养瓶、24 孔培养板(FALCON 产品)，微量移液枪2.5 Μl、10 Μl、100 Μl、1 000 Μl(Eppendorf 产品)，倒置显微镜及显微照相仪(日本Olympus公司)。 　　1.3 方法 　　1.3.1 分组 共分8组，20、40、60、80、100 mg/L榄香组及3 mg/L顺铂组、空白组、PBS阴性对照组，不同浓度的榄香烯由5 mg/L榄香烯原液用1640培养液分别稀释而成。各组均抽取十张载玻片进行观察。 　　1.3.2 细胞培养及爬片 SPC-A-1细胞按常规复苏，置 37℃，5%CO2培养箱中培养。每2～3 d换培养液一次，RPMI 1640培养液(含双抗)中含 10%胎牛血清。4～5 d细胞长满培养瓶底80%～90%时用毛细吸管吸出培养液，加入PBS液冲洗，然后加入1 ml 0.25%胰蛋白酶常温消化，时程以镜下观察细胞收缩变形为止，终止消化。转移入10 ml离心管1 000 r/min离心5 min。把4 cm×4 cm的盖玻片(已高温消毒)平铺于24孔培养板底备用(24孔培养板置紫外灯下照射过夜)。 吸出上层液体加培养液吹打均匀，制备成单细胞悬液，传至24孔放有盖玻片培养板中，每瓶加细胞悬液1 ml，加培养液1 ml(含 10%胎牛血清)，37℃ 5%CO2培养箱中培养 24 h，当电镜下观察到细胞贴壁生长时，分别加入200 Μl不同浓度的榄香烯注射液及顺铂、PBS，空白组加入1640培养液。 　　1.3.3 结果判断标准 按照免疫细胞化学ABC法进行实验，结果判定标准如下： 　　 VEGF-C、VEGFR-3染色强度 标准1：按照胞浆染色着色深浅打分，无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分，深褐色为4分。标准2：按照阳性细胞率打分，阴性为0分，0～10%为1分，10%～50%为2分，50%为3分。 　　 VEGF-C、VEGFR-3 表达强度 表达强度=标准1×标准2，0～2分为(-)，3～4分为(+)，5～7分为()，8～9分为()。 　　 VEGF-C、VEGFR-3阳性指数 低倍镜下分别选取VEGF-C(+)癌细胞、VEGFR-3(+)癌细胞最密集区，然后100倍视野下随机选取10个视野，计出细胞总数和阳性表达细胞数，阳性指数=阳性表达细胞数/细