miRTH克隆及慢病毒载体的构建.pdf

南 通 大 学 学 报 (医 学 版 J · 423· ournalofNantongUniversity (MedicalSciences)2010：30(6 miR—TH克隆及慢病毒载体的构建 刘 燕 ，彭聿平 ，黄 彦 ，黄慧伟 ，邱一华 f南通大学医学院 诊断学教研室 ， 生理学教研室 ，南通 226001) 摘【 要] 目的：克隆microRNA-一酪氨酸羟化酶(rI1H)，构建慢病毒载体。方法：根据 TH基因序~(NM_O~0d9377．1)，设计 并合成4对微小 RNA(miRNA)的OligoDNA，退火形成双链后与 pcDNATM6．2GWE／mGFP—miRNA载体相连 ，用 Gateway 技术将构建好的DcDNAa~6．2-．-GW／EmGFP-一miR—TH载体先后与中间载体 pDONRr~e221、慢病毒载体 pLenti6／V5一DEST 连接，构建慢病毒表达载体 pLenti6／V5一DEST一-TH，用脂质体 2000(1ipofeetamine2ooo)将慢病毒载体 以及包装质粒(pLP1， pLP2和pLP／VSVG)共转染 HEK一293FT细胞 ，收集上清 ，感染 293T细胞株进行滴度鉴定。结果 ：测序结果表 明，4对 pcDNATM6．2一GW／EmGFP—miR—TH表达载体序列与参考序列一致，构建 出来 的慢病毒载体在 293Fr细胞中包装成功， 并通过293T细胞测得慢病毒滴度为 5x10TUm／l。结论 ：成功构建 了TH 的慢病毒干扰载体 pLenti6／V5-一DEST—TH，为利 用 RNA干扰技术进一步研究TH基 因的功能和作用奠定了基础 。 关【键词】微小 RNA；慢病毒载体；酪氨酸羟化酶 【中图分类号】Q782 [文献标志码]A [文章编号] 1674—7887(2010)06-一0423—03 CloningofmiR—TH andconstruction ofitsl[entiviralexpressionvector LIUYah ，PENGYupinf,HUANGYah，HUANGHuiwe~，QIUYihua2 (DepartmentofDiagnostics，2Departmemof Physiology，MedicalCollegeofNantongUniversity,Nantong226001) [Abstract] Objective：Toclonemill—THandconstructitslentiviralexpressionvector．Methods：AccordingtotheTHgene sequence(GenBank：NM一009377．1)，4pairsofOligoDNAsequencesofmiRNAweredesigned．ThesinglestrandofOligo DNA wasannealedtoform doublestrandDNA，andthenconnectedwiththeolasmidpeDNA~M6．2一GW ／EmGFP—miRNA．By usingGatewaytechnology，the expression vectorpcDNAn％．2一GW ／EmGFP— miR-TH washnked into pDONRTM221and pLenti6／V5一DESTtoconstructlentiviralexpression vectorpLenti6／V5一DEST—TH．ThelentiviralexpressionvectorandVi- rapowerTMPakcagingMix(pLP1．pLP2和pLPV／SVG)werecotransfectedintoHEK-293FTcellsbylipofectamine2000trans