PRSV NIa-pro、NIa-vpg、NIb酵母双杂交诱饵表达载体的构建和自激活检测.pdfVIP

第29卷 第3期 热 带 作 物 学 报 Vol.29No.3 2008年6月 CHINESEJOURNALOFTROPICALCROPS Jun.2008 PRSVNIa-pro、NIa-vpg、NIb酵母双杂交诱饵 表达载体的构建及自激活检测 王明钦 沈文涛 周 鹏* 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 海口 571101 摘 要 用PCR技术获得NIa-pro、NIa-vpg、NIb基因片段，将这些基因分别克隆到pBD-GAL4载体中，构建 酵母双杂交系统的诱饵载体pBD-GAL4-NIa-pro、pBD-GAL4-NIa-vpg和pBD-GAL4-NIb。测序正确后，将 重组质粒导入YRG-2酵母菌株，检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。结果表 明，获得了正确的NIa-pro、NIa-vpg、NIb基因片段，并成功克隆到pBD-GAL4诱饵载体中，且转化有诱饵载体 的YRG-2在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好，说明表达产物对酵母细胞无毒性，对报告基因也无自激活 作用，为下一步利用酵母双杂交系统检测与NIa-pro、NIa-vpg、NIb蛋白相互作用的蛋白奠定基础。 关键词 PRSV 酵母双杂交 诱饵载体 构建 检测 中图分类号 S432.4 Q78 番木瓜环斑病毒(Papayaringspotvirus，PRSV)是引起番木瓜病毒病的最主要病毒之一，自从 20世 [1] 纪40年代美国首次报道了PRSV的发生，随后大多数番木瓜主要生产国陆续报道了这一病害 。番木 瓜环斑病毒是马铃薯Y病毒属 (Potyviridae，Potyvirus)成员，为正链RNA病毒，基因组全长 10323bp，编 [2] 码 10种不同功能的病毒蛋白，包括P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-vpg、NIa-pro、NIb和CP 。其中 [3] [4] P1与HC-Pro分别作用于自身的C-末端，而NIa负责切割多聚蛋白质C-末端的其余部分 ，王升吉等 在阐述大豆花叶病毒(SMV)时推测NIa-vpg行使RNA复制起始或参与RNA中间体加工的功能，NIa- pro是含有丝氨酸的胰蛋白酶，推测其重要功能是对基因组的翻译产物进行加工。NIb一般被认为是一 [5] [6] 种依赖于RNA的RNA聚合酶 。近年来对马铃薯Y病毒属编码的蛋白作了较多的研究，DeyinGuo等 构建了马铃薯A病毒(PotatovirusA，PVA)和豌豆种传花叶病毒(PSbMV)蛋白互作图谱，Sung-HwanKang [7] 等 构建了大豆花叶病毒蛋白互作图谱，但未见有PRSV蛋白互作图谱的报道。探明这些蛋白间的相互 作用，对于了解PRSV病毒复制、运动及侵染宿主等过程的机制，从而控制病毒的传播有着重要的意义。 [8] 酵母双杂交技术(yeasttwo-hybridsystem，YTHS)是Fields等 于 1989年建立的研究蛋白质相互作用的 方法。其原理是，将待研究的蛋白分别与转录调节因子GAL4的DNA结合域和转录激活域构成融合蛋 白，如果这两个蛋白之间存在相互作用，就可以将转录激活域带到DNA结合域附近并相互作用，构成 有活性的完整转录因子，激活报告基因表达，通过筛选报告基因，就可以得到含有相互作用蛋白的酵母 细胞，进而完成相互作用蛋白的鉴定。YTHS在研究已知蛋白间的互作以及筛选与诱